p53/microRNA-214/ULK1軸—糖尿病腎病治療的靶點
糖尿病腎病(DKD)中自噬調(diào)節(jié)失調(diào)已有報道，但其潛在機制及其致病作用仍不清楚。今天小編為大家介紹近期發(fā)表于影響因子11.864的雜志“The Journal of Clinical Investigation”的文獻“p53/microRNA-214/ULK1 axis impairs renal tubular autophagy in diabetic kidney disease”，帶大家了解自噬與DKD發(fā)展的機制。
在本文中，自噬在DKD模型和人類糖尿病腎臟中受到抑制。DKD的自噬損傷與ULK1的下調(diào)有關(guān)，ULK1由糖尿病腎細胞和組織中miR-214的上調(diào)介導(dǎo)。從腎臟近端小管切除miR-214可防止糖尿病腎臟ULK1表達降低和自噬受損，從而減少腎臟肥大和蛋白尿。此外，p53的阻斷減弱了miR-214在DKD的誘導(dǎo)，導(dǎo)致更高水平的ULK1和自噬，伴隨著DKD的改善。與非糖尿病樣本相比，糖尿病患者的腎活檢顯示p53和miR-214的誘導(dǎo)，與ULK1和自噬的下調(diào)有關(guān)。我們還發(fā)現(xiàn)p53/miR-214與腎纖維化呈正相關(guān)，但ULK1/LC3與糖尿病患者的腎纖維化呈負相關(guān)。
技術(shù)路線：
結(jié)果：
1) 糖尿病小鼠腎小管細胞自噬減少
為了檢測糖尿病腎臟中的自噬，我們首先測試了Akita 小鼠，一種胰島素基因突變的1型糖尿病模型。Akita小鼠腎組織中LC3-I和LC3-II的水平明顯低于野生型小鼠(圖1A)。免疫組化染色顯示，與WT小鼠相比，Akita小鼠腎小管細胞胞漿中LC3陽性的斑點較少(圖1B)。電子顯微鏡還顯示，與野生型小鼠腎臟相比，Akita小鼠腎臟的腎小管細胞中自噬小泡較少(圖1C)。我們進一步監(jiān)測了Akita小鼠糖尿病期間腎臟自噬變化的時間進程。7周齡時，Akita鼠和WT鼠的腎LC3表達均無差異(圖1D)。LC3在Akita小鼠腎臟中的表達在第9周較低(圖1E)，但這種差異在第11周才具有統(tǒng)計學(xué)意義(圖1F)，表明糖尿病患者腎臟自噬隨時間而減少。
我們還檢測了STZ誘導(dǎo)的C57BL/6小鼠糖尿病中的腎自噬。第11周，STZ處理的小鼠腎臟中LC3-I和LC3-II的表達水平明顯低于對照組小鼠(圖2A)。與未治療的對照組小鼠相比，這些小鼠的腎小管細胞中的LC3點也較少(圖2B)。
在糖尿病腎臟中觀察到的自噬減少可能是由于自噬體形成和/或自溶體降解的變化。因此，我們通過使用CAG-RFP-GFP-LC3-轉(zhuǎn)基因小鼠進一步監(jiān)測自噬動力學(xué)，其中紅色RFP與綠色GFP熒光的點狀共定位指示自噬體，而沒有GFP信號的僅RFP點狀共定位指示自溶體。如圖2C所示，與對照動物相比，STZ處理的小鼠腎小管細胞中的GFP- 和RFP-LC3 斑點明顯較少，表明糖尿病腎的腎小管整體自噬受損。
2）近端小管的自噬缺陷擴大了糖尿病小鼠的腎臟肥大和組織損傷
自噬是細胞分解代謝或降解的過程。因此，我們假設(shè)在糖尿病腎小管中觀察到的自噬損傷可能導(dǎo)致腎臟肥大，這是DKD病的早期發(fā)病特征。為了驗證這一點，我們首先確定了Akita小鼠腎臟近端小管自噬缺陷的影響。我們發(fā)現(xiàn)PT-Atg 7-/-Akita小鼠比PT-Atg7+/+ Akita小鼠具有更高的腎臟/體重比(圖3A)，這表明當(dāng)腎小管自噬被抑制時，糖尿病腎臟會發(fā)生更嚴(yán)重的肥大。腎臟組織學(xué)分析顯示，PT-Atg7-/-Akita小鼠的腎小管細胞嗜酸(圖3B)。此外，PT-Atg7-/- Akita小鼠顯示出腎小管損傷的其他跡象，包括腎小管細胞溶解和腎小管完整性喪失(圖3B)。然后我們檢查了巨噬細胞浸潤。如圖3C所示，我們在非糖尿病WT小鼠(不考慮Atg7表達)和Atg7表達的Akita鼠的腎組織中觀察到很少的巨噬細胞。然而，PT-Atg7-/- Akita小鼠的腎間質(zhì)中有大量巨噬細胞浸潤，表明糖尿病期間近端小管的自噬缺陷促進了腎臟炎癥。我們也用TUNEL染色檢查腎細胞死亡。我們在PT-Atg7+/+ WT腎臟中未檢測到TUNEL陽性細胞。在PT-Atg7–/–WT和PT-Atg7+/+Akita小鼠腎中觀察到少量TUNEL陽性細胞，但在PT-Atg7-/- Akita小鼠腎中發(fā)現(xiàn)更多的TUNEL陽性細胞(圖3D)。
3）腎小管自噬缺陷對DKD的長期影響。
用PAS染色，PT-Atg7-/- Akita小鼠比PT-Atg7+/+ Akita小鼠表現(xiàn)出更嚴(yán)重的腎小管損傷 (圖4A)。此外，我們觀察到PT-Atg7-/- Akita小鼠腎臟間質(zhì)明顯變寬(圖4A)。同樣，Masson’s trichrome染色檢測到PT-Atg7-/- WT和PT-Atg7+/+ Akita小鼠腎間質(zhì)中的邊緣膠原沉積，這在PT-Atg7-/- Akita小鼠中顯著增加(圖4B)。PT-Atg 7-/- Akita小鼠的腎間質(zhì)纖維連接蛋白染色也比其他組的小鼠多(圖4C)。從功能上來說，與WT小鼠相比，PT-Atg7+/+和PT-Atg7-/- Akita小鼠的尿白蛋白/肌酐比(ACR)更高，但PT-Atg 7-/- Akita小鼠的ACR明顯高于PT-Atg7+/+Akita小鼠(圖4D)，這表明腎小管自噬缺乏會加重糖尿病患者的腎功能衰退?？傊?，這些結(jié)果表明，腎臟近端小管的自噬缺陷可能會加重糖尿病患者的腎臟肥大和組織損傷，從而促進DKD病的進展。
4）糖尿病腎臟和高糖孵育的腎小管細胞中ULK1的下調(diào)
為了了解糖尿病腎臟自噬損傷的機制，我們首先通過免疫印跡法分析了Akita小鼠的關(guān)鍵自噬蛋白。我們發(fā)現(xiàn)糖尿病小鼠和它們的同窩仔在腎臟中表達相似水平的Beclin1和Atg5-Atg12復(fù)合物(圖5A)。IHC染色進一步證實了糖尿病腎臟中ULK1的減少，尤其是在腎小管中(圖5B)。類似地，在STZ誘導(dǎo)的糖尿病小鼠中，ULK1的腎表達減少(圖5，C和D)。然而，STZ治療沒有改變小鼠腎臟中Atg7、Atg5或Beclin1的表達(圖5C)。因此，糖尿病腎臟中一個顯著的分子變化是ULK1的下調(diào)，這可能介導(dǎo)糖尿病中的自噬損傷。
5）在糖尿病腎臟中誘導(dǎo)miR-214抑制ULK1的自噬損傷、腎臟肥大和DKD
為了識別特定的microRNAs，我們首先使用miRanda microRNA目標(biāo)預(yù)測數(shù)據(jù)庫(http:/ /www.microrna. org)來預(yù)測可能以ULK1為目標(biāo)的microRNAs。然后我們集中研究了那些與糖尿病和腎臟疾病有關(guān)的microRNAs。生物信息學(xué)分析表明miR-214是一種潛在的microRNAs，可以靶向糖尿病腎臟中的ULK1。我們在從熱帶爪蟾到人類的各種動物物種中鑒定了ULK1基因3’-UTR中的一個保守的miR-214靶向位點(圖6A)。我們進一步檢測到Akita小鼠和STZ誘導(dǎo)的糖尿病小鼠腎臟中miR-214的表達逐漸增加(圖6，B和C)。使用ISH，我們進一步定位了糖尿病腎臟中miR-214的誘導(dǎo)，主要是在近端小管，而不是在腎小球(圖6D)，與非糖尿病WT組織相比，Akita小鼠腎臟中miR-214陽性管狀細胞的數(shù)量顯著增加。在體外RPTCs中，HG誘導(dǎo)miR214增加30%(圖6E)?？傊?，這些結(jié)果證明了糖尿病期間腎小管細胞中miR-214的誘導(dǎo)，伴隨著ULK1的下調(diào)。
為了確定ULK1是否是miR-214的真正靶標(biāo)，我們首先將miR-214轉(zhuǎn)染到人胚胎腎293 (HEK293)細胞中，這導(dǎo)致ULK1表達的顯著降低(圖7A)。相反， miR-214的抑制增強ULK1表達(圖7B)。此外，抗miR214可防止HG誘導(dǎo)的ULK1(圖7B)和LC3-II(圖7C)表達的降低。我們通過熒光素酶報告分析，進一步確定ULK1是否是miR-214的直接靶點。如圖7D所示，共轉(zhuǎn)染miR-214降低了熒光素酶-ULK 1 3’-UTR轉(zhuǎn)染細胞中的熒光素酶表達。值得注意的是，HG孵育也抑制了轉(zhuǎn)染細胞中熒光素酶的表達，當(dāng)miR-214的靶向序列在熒光素酶-ULK1 3’-UTR中突變時，這種作用部分減弱(圖7E)。總之，這些數(shù)據(jù)表明ULK1是miR-214的直接靶標(biāo)，miR-214可能抑制糖尿病中ULK1的表達。
為了證實anti–miR-214的結(jié)果，并進一步闡明miR-214在糖尿病腎臟中的致病作用，我們建立了近端小管特異性miR-214-敲除(PT-miR-214-/-)小鼠模型。PT–miR-214+/+ Akita小鼠腎臟中ULK1和LC3-II的表達降低，這兩種蛋白在PT–MiR-214-/- Akita小鼠中被部分阻止 (圖7，F(xiàn)和G)。此外，PT–miR-214-/-Akita小鼠的腎臟和腎臟重量/體重比小于PT–miR-214+/+ Akita小鼠，這表明miR-214有助于糖尿病患者的腎臟肥大(圖7H)。值得注意的是，PT–miR-214-/- Akita小鼠的腎功能也明顯更好(圖7I)。
6）P53介導(dǎo)糖尿病腎臟中miR-214誘導(dǎo)的自噬損傷、腎臟肥大和DKD
miR-214在DKD是如何誘導(dǎo)的？考慮到這個問題，我們篩選了幾種可能的上游轉(zhuǎn)錄因子，其中p53在Akita和STZ治療的小鼠腎臟中顯著上調(diào)和激活(圖8A)。在體外，RPTCs的HG孵育也誘導(dǎo)p53活化(圖8B)。Pifithrin-α是p53的一種藥理學(xué)抑制劑，可防止HG處理的RPTCs中ULK1和LC3-II表達的降低(圖8，C和D)。值得注意的是，pifithrin-α還降低了HG處理細胞中miR-214的誘導(dǎo)(圖8E)。這些結(jié)果表明p53可能介導(dǎo)腎小管細胞中miR-214的誘導(dǎo)以抑制糖尿病中的ULK1和自噬。
然后，我們使用JASPAR數(shù)據(jù)庫(http:/ /jaspar.genereg.net/)分析miR-214基因的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合譜，并在其啟動子區(qū)鑒定出一個假定的p53結(jié)合位點(圖8F)。為了驗證p53與該位點的結(jié)合，我們進行了ChIP分析以檢測抗p53免疫沉淀中的結(jié)合位點序列。如圖8G所示，HG孵育誘導(dǎo)p53與miR-214基因啟動子序列的結(jié)合增加了2.3倍，該序列具有假定的結(jié)合位點。為了闡明p53是否在體內(nèi)調(diào)節(jié)miR-214，我們使用了我們以前工作中的近端小管特異性p53敲除(PT-p53–/–)小鼠模型。PT-p53-/-小鼠和它們的PT-p53+/+同窩小鼠用STZ治療以誘發(fā)糖尿病。經(jīng)STZ治療后，PT-p53+/+小鼠腎臟中miR-214的誘導(dǎo)作用顯著，而PT-p53-/-小鼠中miR-214的誘導(dǎo)作用減弱(圖9A)。與此同時，糖尿病相關(guān)的ULK1和LC3-II表達的降低在PT-p53-/-小鼠中被抑制(圖9，B和C)。在STZ誘導(dǎo)糖尿病后，PT-p53-/-腎在腎小管中也比PT-p53+/+腎有更多的LC3陽性點或自噬體(圖9D)。在PAS染色中，糖尿病性PT-p53+/+小鼠表現(xiàn)出明顯的腎臟組織病理學(xué)變化，包括腎小管擴張、刷狀緣喪失和腎小管萎縮，這些在糖尿病性PT-p53-/-小鼠中顯著減少(圖9E)。糖尿病期間腎臟重量和腎臟重量/體重比增加，但PT-p53-/-小鼠的增加被部分抑制，表明這些動物的腎臟肥大減少(圖9F)。值得注意的是，在STZ誘導(dǎo)的糖尿病中，PT-p53-/-小鼠的ACR顯著低于PT-p53+/+小鼠(圖9G)，表明腎功能更好。綜上所述，這些結(jié)果表明糖尿病中p53激活以誘導(dǎo)miR-214，miR-214隨后抑制ULK1的表達，導(dǎo)致自噬損傷、腎肥大和DKD。
7）糖尿病患者腎活檢中p53、miR-214、ULK1和LC3的相關(guān)性
我們的動物和細胞模型結(jié)果揭示了p53/miR-214/ULK1途徑，該途徑導(dǎo)致自噬缺陷、腎臟肥大和糖尿病腎功能下降。為了確定這些發(fā)現(xiàn)的臨床相關(guān)性，我們檢測了糖尿病患者腎活檢中p53、miR-214、ULK1和LC3的表達。在IHC分析中，沒有一個對照腎活檢標(biāo)本p53染色陽性，而來自糖尿病患者的20個腎活檢標(biāo)本中有15個顯示p53染色(圖10A)。值得注意的是，在糖尿病腎臟樣本中，p53主要在擴張腎小管的細胞核中表達。ISH顯示，14例對照腎活檢中只有2例miR-214染色陽性，而糖尿病患者20例腎活檢中有15例陽性(圖10B)。有趣的是，miR-214在腎小管中以p53的形式存在，但主要在細胞質(zhì)中。相反，對照腎活檢中的大多數(shù)腎小管對ULK1染色強烈，而糖尿病腎活檢中的許多腎小管對ULK1染色較低(圖11A)。與對照活檢相比，糖尿病患者的腎活檢也顯示明顯較少的LC3點或自噬體(圖11B)。此外，線性回歸分析顯示糖尿病腎活檢中p53和miR-214表達之間(圖12A)以及ULK1和LC3表達之間(圖12B)存在顯著正相關(guān)。相比之下，我們注意到miR-214和ULK1的表達之間(圖12C)以及p53和ULK1的表達之間(圖12D)存在顯著的負相關(guān)。這些結(jié)果提供了進一步支持p53/miR-214/ULK1軸在糖尿病自噬損傷中的作用，并建立其臨床相關(guān)性。
結(jié)論：我們在DKD的實驗?zāi)Ｐ秃吞悄虿』颊叩哪I臟中都證實了腎小管細胞的自噬功能障礙。自噬損傷有助于腎臟肥厚，相關(guān)病理，以及DKD的進展。機制上，我們發(fā)現(xiàn)p53誘導(dǎo)了DKD中的miR-214，抑制了自噬啟動的關(guān)鍵蛋白激酶ULK1，導(dǎo)致自噬損傷。