鳶尾素抑制膿毒癥小鼠肝臟內(nèi)鐵死亡

研究背景：鐵死亡是一種鐵依賴的程序性細(xì)胞死亡，研究認(rèn)為鐵死亡與膿毒癥的發(fā)病機(jī)制有關(guān)。運(yùn)動中釋放的肌動素鳶尾素在各種條件下都能改善線粒體功能。鐵死亡與線粒體功能密切相關(guān)。然而，鳶尾素在膿毒癥誘導(dǎo)的肝臟鐵死亡和線粒體功能障礙中的作用尚不清楚。陜西省再生醫(yī)學(xué)中心Shasha Wei在Clinical and Translational Medicine（IF=7.919）上發(fā)表文章，研究鳶尾素治療對膿毒癥患者的鐵死亡的作用。

技術(shù)路線圖：

研究結(jié)果：

1.膿毒癥患者血清中鳶尾素水平與健康對照組比較

比較60名膿毒癥患者和29名健康受試者，發(fā)現(xiàn)健康人體內(nèi)鳶尾素水平高。膿毒癥患者血清中鳶尾素水平與APACHE II評分（判斷危重患者的病情嚴(yán)重程度）存在相關(guān)性。在膿毒癥患者中，血清鳶尾素水平下降與疾病嚴(yán)重程度呈負(fù)相關(guān)。

Figure 1

2. 膿毒癥動物模型血清中鳶尾素水平

與臨床結(jié)果一致， CLP小鼠術(shù)后12H、24 h，血清鳶尾素水平顯著降低(圖2A)。在LPS誘導(dǎo)的小鼠中，血清鳶尾素水平也顯著降低，且以LPS劑量依賴性下降(圖2B)。鳶尾素主要在骨骼肌中表達(dá)，lps誘導(dǎo)的膿毒癥小鼠骨骼肌中FNDC5 mRNA水平明顯降低(圖2C)，提示膿毒癥小鼠骨骼肌中鳶尾素的表達(dá)減少。

Figure 2

3. 鳶尾素抑制CLP誘導(dǎo)的膿毒癥老鼠的鐵死亡

谷胱甘肽過氧化物酶4 (GPX4)鐵蛋白水平呈負(fù)相關(guān)。圖3A和3B顯示，術(shù)后24小時CLP小鼠肝臟GPX4水平明顯降低。而鳶尾素治療后CLP小鼠肝臟中GPX4表達(dá)明顯升高(圖3C,D)。GPX4的表達(dá)，谷胱甘肽含量，脂質(zhì)過氧化，鐵積累和線粒體形態(tài)是表征鐵死亡的關(guān)鍵指標(biāo)。膿毒癥小鼠肝臟GSH含量明顯降低，MDA和Fe²⁺水平明顯升高，線粒體萎縮，雙層密度增高。鳶尾素處理逆轉(zhuǎn)了這些指標(biāo)的水平，并在形態(tài)學(xué)上減輕了線粒體損傷(圖3E-H)。這些結(jié)果表明，膿毒癥小鼠肝臟鐵死亡增多，而鳶尾素處理降低了膿毒癥小鼠的鐵死亡。除肝臟外，鳶尾素還能抑制CLP小鼠肺內(nèi)鐵死亡。 

Figure 3

4. 鳶尾素抑制CLP誘導(dǎo)的膿毒癥小鼠的炎癥反應(yīng)

膿毒癥時炎癥因子的過度增加導(dǎo)致器官損傷。鳶尾素可以顯著降低膿毒癥小鼠血清IL-6和TNF- a的水平(圖4A,B)。經(jīng)鳶尾素處理后，膿毒癥小鼠肝臟中IL-6、IL-1、CXCL1和CXCL10mRNA的表達(dá)顯著降低(圖4C)。同樣，鳶尾素處理降低腎臟中IL-6和IL-1的水平，肺部IL-6、TNF-a和IL-1的水平，心臟中IL-6、TNF-a和CXCL1的表達(dá)。鳶尾素抑制了膿毒癥小鼠的全身炎癥。

Figure 4

5. 鳶尾素可減輕膿毒癥小鼠線粒體損傷

如圖5A，CLP手術(shù)導(dǎo)致線粒體腫脹，線粒體嵴消失，線粒體外膜破裂，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腫脹。在鳶尾素治療組，這些改變明顯減輕。為了探究鳶尾素是否對線粒體生物發(fā)生有影響，通過qPCR檢測mtDNA拷貝數(shù)(mtDNA/nDNA)，在載體組中mtDNA拷貝數(shù)(mtDNA/nDNA)明顯下降，而外源性鳶尾素處理增加了mtDNA拷貝數(shù)(圖5B)。線粒體腫脹和線粒體外膜破裂提示線粒體功能受損。WB結(jié)果顯示ATPB(與能量產(chǎn)生相關(guān)的蛋白質(zhì))和TFAM(線粒體生物發(fā)生相關(guān)蛋白)這兩種蛋白在CLP中均顯著下調(diào)，而在鳶尾素處理組中顯著上調(diào)(圖5C-E)。
Figure 5

6. 鳶尾素增加膿毒癥小鼠和LPS刺激的L02細(xì)胞中線粒體活性和ATP的產(chǎn)生

肝線粒體活性用絲分裂追蹤器紅色評價，CLP誘導(dǎo)的膿毒癥小鼠的紅色熒光強(qiáng)度明顯降低。外源鳶尾素處理明顯增加了熒光強(qiáng)度(圖6A,B)。肝臟ATP含量可以反映線粒體能量代謝。溶劑對照組中ATP含量顯著降低，而鳶尾素處理后ATP含量顯著增加(圖6C)。L02細(xì)胞經(jīng)脂多糖處理后，絲分裂追蹤器紅色的熒光強(qiáng)度和ATP含量顯著降低，而鳶尾素處理可逆轉(zhuǎn)這種影響(圖6D,E)

Figure 6

7. 鳶尾素可以減輕膿毒癥小鼠和LPS刺激的L02細(xì)胞中氧化應(yīng)激水平

溶劑對照組中ROS顯著增加，但鳶尾素處理顯著降低了ROS的產(chǎn)生(圖7A,B)。100 ng/mL鳶尾素處理可以逆轉(zhuǎn)LPS刺激的LO2細(xì)胞中ROS水平 (圖7C,D)?？傊S尾素治療可調(diào)節(jié)膿毒癥中的氧化應(yīng)激。

Figure 7

8. GPX4抑制劑消除鳶尾素在膿毒癥中的作用

在L02細(xì)胞中，觀察鐵死亡是否參與鳶尾素對膿毒癥的保護(hù)作用。在L02細(xì)胞中觀察到GPX4顯著下調(diào)，而鳶尾素處理后GPX4蛋白水平顯著升高(圖8A,B)。RSL3是一種誘導(dǎo)鐵死亡的GPX4特異性抑制劑，用于體外檢測線粒體活性和ROS的產(chǎn)生。RSL3、LPS和鳶尾素處理24小時后，L02細(xì)胞紅色熒光強(qiáng)度明顯降低，ROS的產(chǎn)生顯著增加(圖8C)。與此同時，RSL3處理的L02細(xì)胞中GPX4、ATPB和TFAM蛋白表達(dá)明顯下調(diào)(圖8D-G)。GPX4的下調(diào)顯示RSL3的強(qiáng)烈抑制作用，而ATPB和TFAM的下調(diào)則表明RSL3處理后線粒體功能受損。RSL3與鳶尾素處理導(dǎo)致膿毒癥小鼠GPX4和TFAM蛋白水平明顯降低(圖9A,B)，而ROS生成明顯升高(圖9C,D)。 RSL3處理消除了鳶尾素對GSH、MDA和Fe²⁺的有益作用(圖9E-G)。RSL3處理血清中ALT、AST、IL-6、TNF和肝臟中IL-6、IL-1、CXCL-1 mRNA表達(dá)明顯升高(圖9J)。以上結(jié)果表明，RSL3通過抑制GPX4破壞了鳶尾素對肝臟線粒體功能、ROS產(chǎn)生、肝臟損傷和全身炎癥的保護(hù)作用。綜上所述，鐵死亡的增強(qiáng)消除了鳶尾素對膿毒癥的保護(hù)作用。

Figure 8

Figure 9

9. 整合素抑制劑消除鳶尾素對GPX4和線粒體功能的影響

在骨細(xì)胞細(xì)胞系中，αV整合蛋白被鑒定為鳶尾素的受體，刺激信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。為了確定鳶尾素是否會影響鐵死亡和肝線粒體，鳶尾素受體的抑制劑(精氨酸肽和Echistain)在LPS和鳶尾素存在的情況下處理L02細(xì)胞，對比鳶尾素組和RGD陰性對照組， GPX4蛋白表達(dá)、絲分裂追蹤器熒光強(qiáng)度和ATP含量均顯著降低(圖10)。抑制鳶尾素的作用促進(jìn)了鳶尾素和脂多糖處理的L02細(xì)胞的鐵死亡和線粒體功能受損。

Figure 10