國(guó)自然熱點(diǎn)-自噬

2020年國(guó)自然已塵埃落定，2021年國(guó)自然申請(qǐng)又即將開始。那么接下來(lái)小編給大家介紹一下國(guó)自然熱點(diǎn)之一—自噬。自噬從2010到2017申請(qǐng)的相關(guān)項(xiàng)目一直在上升，近兩年稍有回落，但也多達(dá)500多項(xiàng)。其中腫瘤學(xué)相關(guān)的研究遙遙領(lǐng)先。話不多說(shuō)，今天和大家分享一篇自噬相關(guān)的文章。

這篇發(fā)表于影響因子10.717的“Cell Death & Differentiation”雜志的文章“DAPK3 inhibits gastric cancer progression via activation of ULK1-dependent autophagy” 報(bào)道了DAPK3在胃癌細(xì)胞中誘導(dǎo)自噬的抑癌作用。DAPK3在GC中的抑癌作用與自噬相關(guān)，DAPK3是一種新型的自噬調(diào)節(jié)因子，可以直接磷酸化ULK1并激活ULK1。因此，DAPK3可能是一個(gè)潛在的預(yù)后的自噬相關(guān)標(biāo)志物。

結(jié)果：
1）DAPK3在胃癌細(xì)胞中顯示腫瘤抑制活性

我們前期研究表明DAPK3的表達(dá)與胃癌晚期臨床分期和不良預(yù)后呈負(fù)相關(guān)。為了深入了解DAPK3在胃癌細(xì)胞中的腫瘤抑制功能，我們進(jìn)行了以下實(shí)驗(yàn)。 XTT增殖試驗(yàn)顯示DAPK3顯著抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)速率(圖1a)。病灶形成和軟瓊脂試驗(yàn)顯示DAPK3顯著降低了依賴錨定和獨(dú)立細(xì)胞中的集落頻率和大小(圖1b，c)。MGC803和GES-1細(xì)胞中DAPK3的敲除強(qiáng)烈促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)和集落形成(圖1a-c)。為了驗(yàn)證DAPK3對(duì)體內(nèi)腫瘤生長(zhǎng)的影響，建立了皮下異種移植瘤小鼠模型。我們發(fā)現(xiàn)，空載體轉(zhuǎn)染的MKN45細(xì)胞在注射后7天內(nèi)就可以看到腫瘤，而DAPK3轉(zhuǎn)染的MKN45細(xì)胞直到注射后3周才觀察到腫瘤(圖1d)。動(dòng)力學(xué)圖顯示由DAPK3沉默的MGC803細(xì)胞產(chǎn)生的腫瘤明顯大于來(lái)自對(duì)照細(xì)胞的腫瘤(圖1d)。傷口愈合和transwell試驗(yàn)表明，DAPK3過(guò)表達(dá)后細(xì)胞遷移和侵襲明顯減少，DAPK3敲除后細(xì)胞遷移和侵襲增加(圖1e，f)。另外，與對(duì)照細(xì)胞相比，DAPK3過(guò)表達(dá)的MKN45和MKN28細(xì)胞顯示出G0/G1期細(xì)胞百分比的顯著增加。同時(shí)，當(dāng)DAPK3沉默時(shí)，我們觀察到MGC803和GES-1細(xì)胞中G0/G1期細(xì)胞的百分比顯著降低(圖1g)。

2）氨基酸剝奪誘導(dǎo)自噬需要DAPK3

我們研究了DAPK3是否調(diào)節(jié)胃癌細(xì)胞的自噬。蛋白質(zhì)印跡分析顯示，EBSS處理促進(jìn)自噬后，內(nèi)源性DAPK3蛋白水平顯著增加(圖2a)。類似地，DAPK3過(guò)表達(dá)增加了LC3-II/LC3-I比率。同時(shí)，在氨基酸饑餓條件下，SQSTM1/p62水平在DAPK3過(guò)表達(dá)的細(xì)胞中顯著降低 (圖2b)。此外，在DAPK3過(guò)表達(dá)的細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)LC3的數(shù)量增加，表明DAPK3增強(qiáng)了自噬體的形成(圖2c)。透射電鏡顯示，與對(duì)照細(xì)胞相比，DAPK3過(guò)表達(dá)細(xì)胞中含有細(xì)胞質(zhì)結(jié)構(gòu)和殘留消化物質(zhì)的自噬空泡顯著增加(圖2d)。MGC803和GES-1細(xì)胞中DAPK3的敲除顯著損害了LC3-I向LC3-II的轉(zhuǎn)化、SQSTM1/p62的降解、GFP-LC3的積累和氨基酸饑餓期間自噬空泡的形成(圖2d)。因此，DAPK3是誘導(dǎo)氨基酸饑餓介導(dǎo)的自噬所必需的。

3）  ATG5或ATG7缺失抑制的自噬會(huì)削弱DAPK3的腫瘤抑制功能

為了確定DAPK3介導(dǎo)的自噬是否與其腫瘤抑制功能相關(guān)，在DAPK3過(guò)表達(dá)細(xì)胞和空載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞中，抑制ATG5或ATG7。ATG5或ATG7的敲除顯著降低了DAPK3過(guò)表達(dá)細(xì)胞中LC3-I向LC3-II的轉(zhuǎn)化、SQSTM1/P62降解和GFP-LC3形成，表明DAPK3誘導(dǎo)的自噬受到ATG5或ATG7耗竭的損害(圖3a，b)。接下來(lái)，我們研究了自噬抑制對(duì)DAPK3過(guò)表達(dá)細(xì)胞和空載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞的細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的影響。細(xì)胞生長(zhǎng)試驗(yàn)顯示細(xì)胞生長(zhǎng)速率在ATG5或ATG7缺失的DAPK3過(guò)表達(dá)細(xì)胞明顯高于對(duì)照組細(xì)胞。同時(shí)，ATG5或ATG7敲除促進(jìn)細(xì)胞遷移和侵襲(圖3c-e)。這些結(jié)果表明，ATG5或ATG7敲除可以挽救DAPK3誘導(dǎo)的GC細(xì)胞的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移阻滯。

4）  DAPK3通過(guò)ULK1激活調(diào)節(jié)自噬

為了闡明DAPK3介導(dǎo)的自噬的分子機(jī)制，我們使用基于質(zhì)譜的定量磷酸化蛋白質(zhì)組分析來(lái)分析在氨基酸饑餓下DAPK3過(guò)表達(dá)的MKN28細(xì)胞和對(duì)照細(xì)胞中差異表達(dá)的蛋白質(zhì)。與對(duì)照細(xì)胞相比，我們觀察到DAPK3過(guò)表達(dá)細(xì)胞中Ser556的ULK1磷酸化增加了大約兩倍。免疫印跡分析顯示氨基酸饑餓后DAPK3過(guò)表達(dá)細(xì)胞中Ser556上ULK1磷酸化水平的顯著上調(diào)(圖4a)。我們還檢測(cè)了Beclin-1的磷酸化狀態(tài)，Beklin-1是ULK1的底物，是VPS34復(fù)合物激活和完全自噬誘導(dǎo)所必需的。正如預(yù)期的那樣，DAPK3增加了Ser15的Beclin-1磷酸化，表明DAPK3調(diào)節(jié)ULK1激活(圖4a)。此外，ULK1敲除強(qiáng)烈抑制自噬通量、自噬體形成，并增強(qiáng)DAPK3過(guò)表達(dá)細(xì)胞在體外的致瘤性(圖4b-g)。在接種了ULK1沉默的MKN45-DAPK3細(xì)胞的裸鼠中，腫瘤大小顯著增加，表明DAPK3介導(dǎo)的腫瘤抑制依賴于ULK1的激活(圖4h)。

5）  DAPK3通過(guò)Ser556的直接磷酸化激活ULK1

為了研究DAPK3直接磷酸化ULK1的可能性，我們使用了GPS軟件來(lái)預(yù)測(cè)DAPK3的ULK1磷酸化位點(diǎn)，并發(fā)現(xiàn)ULK1可能在Ser556被DAPK3磷酸化(圖5a)。DAPK3在Ser556磷酸化重組ULK1，提示DAPK3可以直接在Ser556磷酸化ULK1(圖5b)。DAPK3還在體外激酶測(cè)定中強(qiáng)烈磷酸化Ser556 位點(diǎn)的ULK1，在氨基酸饑餓狀態(tài)下，ULK1的Ser556位點(diǎn)磷酸化水平進(jìn)一步提高(圖5c)。然而，Ser556突變顯著阻礙了該位點(diǎn)的磷酸化(圖5c)。為了進(jìn)一步驗(yàn)證體內(nèi)ULK1中DAPK3磷酸化位點(diǎn)，我們通過(guò)免疫沉淀來(lái)檢測(cè)Ser556位點(diǎn)ULK1磷酸化。正如預(yù)期的那樣，在DAPK3過(guò)表達(dá)的細(xì)胞中觀察到高水平的ULK1 Ser556磷酸化(圖5d)。WT DAPK3過(guò)表達(dá)導(dǎo)致的Ser556 ULK 1磷酸化的增加明顯高于DAPK3 K42A過(guò)表達(dá)導(dǎo)致的增加，表明DAPK3激酶活性是ULK1 Ser556磷酸化所必需的(圖5e)。

接下來(lái)，我們將HA-ULK1作為關(guān)鍵分子進(jìn)行免疫沉淀，并分析了在DAPK3過(guò)表達(dá)細(xì)胞和空載體對(duì)照細(xì)胞中ULK1和其他ULK1復(fù)合物成分之間的相互作用。DAPK3表達(dá)在饑餓條件下顯著增強(qiáng)了WT ULK1與其結(jié)合配偶體FIP200、ATG13和ATG101之間的相互作用，而ULK1中Ser556磷酸化位點(diǎn)的缺失部分削弱了這些相互作用(圖5d)。ATG101在anti-Flag免疫沉淀中被發(fā)現(xiàn)，饑餓后WT DAPK3細(xì)胞中ATG101的量增加。饑餓時(shí)，F(xiàn)IP200和ATG13與標(biāo)記的WT DAPK3共免疫沉淀(圖5e)。ULK1通過(guò)直接磷酸化Beclin1和ATG14L，有利于VPS34復(fù)合物的激活。于是我們通過(guò)蛋白質(zhì)印跡分析探討了DAPK3在VPS34復(fù)合物中的作用。研究表明，在饑餓條件下激活HEK293T細(xì)胞中的VPS34復(fù)合物需要ULK1 Ser556的磷酸化和DAPK3激酶活性(圖5f，g)。總的來(lái)說(shuō)，這些數(shù)據(jù)表明DAPK3對(duì)ULK1的磷酸化增強(qiáng)了ULK1復(fù)合物的形成和饑餓時(shí)VPS34復(fù)合物的活化。

6）  ULK1中的Ser556磷酸化促進(jìn)DAPK3介導(dǎo)的自噬和腫瘤抑制

為了確定ULK1磷酸化在DAPK3調(diào)節(jié)的自噬和腫瘤抑制中的功能意義，我們將WT ULK1或S556A ULK1 cDNA轉(zhuǎn)染到DAPK3過(guò)表達(dá)和空載體的MKN45細(xì)胞中。DAPK3過(guò)表達(dá)的MKN45細(xì)胞在shRNA誘導(dǎo)的內(nèi)源性ULK1下調(diào)下表現(xiàn)出自噬缺陷和致瘤性增加。WT ULK1 cDNA的重建恢復(fù)了自噬和腫瘤抑制(圖6a，c，d)。為了進(jìn)一步評(píng)估UKL1磷酸化對(duì)體內(nèi)腫瘤生長(zhǎng)的影響，我們進(jìn)行了腫瘤異種移植實(shí)驗(yàn)。帶有WT ULK1的DAPK3過(guò)表達(dá)MKN45細(xì)胞的異種移植物生長(zhǎng)速度比來(lái)自S556A突變表達(dá)細(xì)胞的異種移植物生長(zhǎng)速度慢。與空載體對(duì)照細(xì)胞相比，WT ULK1表達(dá)在DAPK 3過(guò)表達(dá)的MKN45細(xì)胞中顯示出更顯著的腫瘤生長(zhǎng)抑制作用(圖6g)。然后我們分析了DAPK3激酶活性對(duì)自噬誘導(dǎo)和腫瘤抑制的重要性。與DAPK3 K42A細(xì)胞相比，含有DAPK3 WT的MGC803細(xì)胞顯示出更高的自噬水平和更低的細(xì)胞生長(zhǎng)率、運(yùn)動(dòng)性和侵襲性(圖6b，e，f)。綜上所述， DAPK3的激酶活性和Ser556的ULK1磷酸化是DAPK3功能所必需的。

7）  DAPK3的表達(dá)與手術(shù)GC標(biāo)本中Ser556和LC3B的ULK1磷酸化呈正相關(guān)

我們的體外研究表明，DAPK3對(duì)ULK1 Ser556的磷酸化對(duì)自噬誘導(dǎo)和腫瘤抑制至關(guān)重要。相關(guān)分析表明DAPK3表達(dá)與GC組織中pULK1 Ser556和LC3B的免疫染色呈正相關(guān)(圖7a，b)。Kaplan-Meier分析顯示，DAPK3和pULK1 Ser556共表達(dá)的患者具有更長(zhǎng)的總生存期和癌癥特異性生存期。同樣，DAPK3和LC3B的共同表達(dá)預(yù)示著患者的良好預(yù)后(圖7c，d)。這些數(shù)據(jù)表明DAPK3相關(guān)的自噬對(duì)人胃癌的進(jìn)展有明顯的抑制作用。