順鉑和溶瘤病毒調(diào)節(jié)囊泡轉(zhuǎn)運(yùn)，激活抗腫瘤免疫

研究背景：鉑耐藥限制了其在惡性腫瘤中的臨床應(yīng)用。研究發(fā)現(xiàn)鉑耐藥是由于細(xì)胞藥物外排增加，DNA修復(fù)的激活和治療后生存途徑的誘導(dǎo)。已有研究報(bào)道CP和oHSV聯(lián)用在肺癌和膀胱癌中的研究，并且溶瘤性牛痘和腺病毒對(duì)卵巢癌有治療效果，美國(guó)德克薩斯大學(xué)洪邦星等人在臨床癌癥研究這一雜志上發(fā)表文章，研究了oHSV感染后癌細(xì)胞順鉑外排情況和抗腫瘤免疫。

技術(shù)路線圖：

研究結(jié)果：

1.溶瘤性HSV (oHSV)感染增加順鉑耐藥的卵巢癌細(xì)胞中順鉑的保留

感染RAMBO之后卵巢癌細(xì)胞中CP含量顯著增加(圖1B和 C)，熒光共聚焦顯微鏡顯示， RAMBO感染細(xì)胞內(nèi)觀察到的CP在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞器中。文章通過(guò)RNA測(cè)序分析了RAMBO感染細(xì)胞和未感染細(xì)胞之間基因表達(dá)變化分析CP保留增加的分子機(jī)制。差異表達(dá)(DE)基因的GO和KEGG通路分析顯示，細(xì)胞外泌體相關(guān)通路中的基因存在顯著的全局失調(diào)(圖1D)。熱圖分析顯示，在感染RAMBO的細(xì)胞中，幾乎所有與細(xì)胞外泌體相關(guān)的基因均顯著下調(diào)(圖1E)。溶酶體途徑中基因表達(dá)變化的熱圖結(jié)果類似 (圖1F)。共聚焦熒光顯微鏡顯示CP與溶酶體標(biāo)記LAMP-1共定位(圖1G)。這些結(jié)果說(shuō)明RAMBO病毒感染導(dǎo)致囊泡運(yùn)輸?shù)母淖?，?dǎo)致CP保留增加。

ATP11B和ATP7B這兩種囊泡膜蛋白與CP外排有關(guān)。感染后兩種OC細(xì)胞的ATP11B和ATP7B蛋白表達(dá)均顯著降低。單獨(dú)或聯(lián)合沉默這兩個(gè)基因可導(dǎo)致CP保留增加(圖1I)。當(dāng)這兩個(gè)基因過(guò)表達(dá)時(shí)，OC細(xì)胞的CP保留顯著減少(圖1J)。通過(guò)外泌體/溶酶體途徑對(duì)CP的外排會(huì)受到OV感染的影響。

Figure 1

2. oHSV和CP增加DNA損傷和STING介導(dǎo)的免疫

在兩種不同的OC細(xì)胞系TR127和TR182中，用RAMBO處理的細(xì)胞中，cp特異性DNA加合物顯著增加(圖2A)。，聯(lián)合使用RAMBO和CP的OC細(xì)胞系中p-H2AX和p-CHK2蛋白（當(dāng)DNA損傷）均有所增加(圖2B)。熒光顯微鏡分析顯示CP和RAMBO聯(lián)合處理的細(xì)胞中微核的存在有所增加(圖2C)。對(duì)四個(gè)組（細(xì)胞進(jìn)行基因表達(dá)分析，發(fā)現(xiàn)控制病毒防御反應(yīng)、炎癥反應(yīng)和I型干擾素信號(hào)通路的基因本體論(GO)途徑顯著增加(圖2D)。基因集富集分析(GSEA)也顯示，CP和RAMBO聯(lián)合處理的細(xì)胞中STING-IFN通路顯著富集(圖2E)。通過(guò)cGAMP分泌和IFN基因表達(dá)，我們發(fā)現(xiàn)與單獨(dú)治療的細(xì)胞相比，聯(lián)合使用RAMBO和CP治療的細(xì)胞cGAS/STING通路被顯著激活(圖2F和G)。

Figure2

3. RAMBO和CP共處理OC細(xì)胞激活天然抗腫瘤免疫

用CP和/或RAMBO處理原代人OC細(xì)胞，結(jié)果顯示兩種實(shí)際連用導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞死亡增加 (圖3 A和B)。當(dāng)聯(lián)合處理的細(xì)胞疊加到人源PBMCs, OC細(xì)胞對(duì)PBMC介導(dǎo)的腫瘤殺傷的敏感性顯著增加(圖3A和B)。此外，聯(lián)合培養(yǎng)腫瘤細(xì)胞的PBMCs釋放的IFN也顯著增加，說(shuō)明PBMC活化增強(qiáng)(圖3C)。STING的激活也可以誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞上的NKG2D配體。聯(lián)合處理的OVTOKO細(xì)胞NKG2D配體表達(dá)顯著增加(圖3D)。用RAMBO和CP處理的OVTOKO細(xì)胞與人供者來(lái)源的NK細(xì)胞共培養(yǎng)，流式細(xì)胞術(shù)發(fā)現(xiàn)CD56+ NK細(xì)胞上NKG2D表達(dá)明顯增加，IFN分泌明顯增加 (圖3E和F)。

Figure 3

4. CP和RAMBO聯(lián)合對(duì)人源性順鉑耐藥OC的體內(nèi)抗腫瘤效果

NSG小鼠腹腔內(nèi)植入表達(dá)熒光素酶和GFP的TR182細(xì)胞(TR182- luci -GFP) (圖4A) IVIS活體成像顯示，聯(lián)合使用RAMBO和CP的小鼠腫瘤負(fù)荷顯著降低(圖4B和C)。聯(lián)合治療顯示腫瘤結(jié)節(jié)的數(shù)量和腫瘤重量顯著減少(圖4D和E)。流式細(xì)胞術(shù)分析GFP +腫瘤細(xì)胞顯示剩余腫瘤結(jié)節(jié)中腫瘤細(xì)胞的百分比顯著下降(圖4F)。通過(guò)H& E和Ki67染色對(duì)腫瘤切片進(jìn)行免疫組化分析，發(fā)現(xiàn)聯(lián)合用藥的小鼠腫瘤細(xì)胞增殖減少(圖4G)。流式細(xì)胞儀對(duì)腫瘤結(jié)節(jié)的免疫表型顯示，聯(lián)合治療小鼠的CD206+ M2巨噬細(xì)胞的百分比顯著減少，而CD86+ M1巨噬細(xì)胞顯著增加(圖4H)。這些結(jié)果表明聯(lián)合治療小鼠的免疫抑制整體降低。與CP治療的小鼠相比，RAMBO治療顯著增加了腫瘤中的鉑保留。使用RAMBO和CP的小鼠腫瘤結(jié)節(jié)顯示cGAMP水平明顯高于一種試劑單獨(dú)處理(圖4J)。

Figure 4

5. RAMBO和CP對(duì)抗腫瘤免疫的誘導(dǎo)作用

在C57BL/6小鼠腹腔內(nèi)植入ID8 -熒光素酶(ID8-Luc)細(xì)胞，處理時(shí)間點(diǎn)如圖 5A。IVIS成像顯示使用RAMBO和CP治療的小鼠的腫瘤生長(zhǎng)顯著減少(圖5B C)，小鼠的腹部腹水明顯減少(圖5D)。對(duì)小鼠的脾細(xì)胞進(jìn)行分析(RAMBO后3天)，聯(lián)合治療小鼠的CD4、CD8 T細(xì)胞(圖5e)和NK細(xì)胞(圖5f)釋放的IFN細(xì)胞均有所增加。CD86+CD11c+和MHCII+CD11c+樹突狀細(xì)胞(DCs)在聯(lián)合治療小鼠中的比例也有所增加(圖5G)。

為了檢驗(yàn)聯(lián)合治療對(duì)體外DC活化的影響， OVTOKO與RAMBO、CP或兩者在改良的小室中與人pbmc來(lái)源的DC細(xì)胞共培養(yǎng)。聯(lián)合治療的OVTOKO細(xì)胞共培養(yǎng)的樹突細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)DNA和線粒體DNA含量顯著增加(圖5H)。聯(lián)合治療后兩種OC和DC細(xì)胞中cGAS基因表達(dá)顯著增加(圖5I左圖OC, 圖5I右圖DC)。DC與聯(lián)合處理的OCs共培養(yǎng)誘導(dǎo)產(chǎn)生大量IFN干擾素，當(dāng)樹突狀細(xì)胞敲除STING時(shí)，功能被抑制（(圖5J）。結(jié)果表明STING信號(hào)在CP和RAMBO聯(lián)合處理的OC細(xì)胞的DC反應(yīng)中起重要作用。

評(píng)估DC活化對(duì)T細(xì)胞活化的影響，將經(jīng)過(guò)RAMBO和/或CP處理的OVTOKO細(xì)胞與DCs和CD3+ T細(xì)胞共培養(yǎng)96小時(shí)。當(dāng)這些細(xì)胞與聯(lián)合治療的OC細(xì)胞共培養(yǎng)時(shí)，細(xì)胞的CD44+CD4+和CD44+CD8+均顯著升高(圖5K)。當(dāng)T細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞與用CP和RAMBO處理的OC細(xì)胞共培養(yǎng)時(shí)，IFN的分泌顯著增加 (圖5L)。CP和RAMBO處理的小鼠T細(xì)胞表面PD1的表達(dá)與單獨(dú)RAMBO處理相比沒有顯著變化(圖5)。

Figure 5