人類胎兒生長(zhǎng)受限的核心調(diào)控模塊和基因特征

胎兒生長(zhǎng)受限（FGR）是造成圍產(chǎn)期死亡和發(fā)病的主要原因，影響胎兒長(zhǎng)期健康。為了確定妊娠期核心基因表達(dá)網(wǎng)絡(luò)和基因特征，結(jié)合超聲確認(rèn)可以更有效地區(qū)分胎齡和病理性FGR群體的正常體質(zhì)，作者對(duì)臍帶血進(jìn)行了全轉(zhuǎn)錄組測(cè)序。本文于2020年9月發(fā)表于《Clinical and translational medicine》期刊上。

技術(shù)路線如下：

主要研究結(jié)果如下：

1、FGR和對(duì)照臍帶血的轉(zhuǎn)錄組明顯不同

對(duì)正常組和FGR組的臍帶血進(jìn)行全轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，如圖1， 作者分析了兩種情況下的蛋白編碼基因、lncRNAs和miRNAs的差異表達(dá)情況，其中蛋白編碼基因在FGR組傾向于下調(diào)表達(dá)，而lncRNAs和miRNAs則傾向于上調(diào)表達(dá)。作者還列舉了FGR家族的代表性表達(dá)情況（圖1d和e）。

圖1 FGR和對(duì)照臍帶血的轉(zhuǎn)錄組明顯不同

 2、差異表達(dá)的蛋白質(zhì)編碼基因和生理功能信號(hào)通路

總計(jì)鑒定到339個(gè)差異表達(dá)的蛋白質(zhì)編碼基因，與對(duì)照相比，在FGR組上調(diào)的有224個(gè)，下調(diào)的是115個(gè)。圖2b-c是下調(diào)的基因富集到的GO條目和KEGG通路；圖2d-e是下調(diào)的基因富集到的GO條目和KEGG通路。隨后作者使用GSEA分析了這些差異表達(dá)基因涉及的信號(hào)通路，如圖2f-i。

圖2差異表達(dá)的蛋白質(zhì)編碼基因和生理功能信號(hào)通路

 3、差異表達(dá)的miRNA和生理功能信號(hào)通路

基于具有較大log2（倍數(shù)變化）的前30個(gè)高度變化的miRNA，包括13個(gè)顯著差異表達(dá)的miRNAs，預(yù)測(cè)它們的靶基因，并展示出最常見的前30個(gè)靶基因（圖3b）。隨后分析了這些靶基因的GO和KEGG分析的結(jié)果（圖3c-d）。利用人類MicroRNA疾病數(shù)據(jù)庫(kù)(HMDD, v2.0)對(duì)預(yù)測(cè)靶點(diǎn)和人類疾病的綜合分析表明，這些miRNA與免疫細(xì)胞和已發(fā)表的疾病顯著相關(guān)（圖3e）。此外，這些miRNA優(yōu)先聚類于miR-194家族和Chr14_100911139-100911213 cluster（圖3f-g）。上述結(jié)果表明這些差異表達(dá)的miRNAs不僅與FGR相關(guān)的疾病有關(guān)，而且還集中于特定的基因簇和各種疾病。

圖3差異表達(dá)的miRNA和生理功能信號(hào)通路

 4、FGR的核心調(diào)控網(wǎng)絡(luò)和印跡基因

測(cè)序中總計(jì)鑒定到79個(gè)顯著下調(diào)和216個(gè)顯著上調(diào)的lncRNAs（圖4a）。研究發(fā)現(xiàn)在339個(gè)編碼基因和295個(gè)lncRNAs間顯示出7個(gè)lncRNAs在一個(gè)2kb的區(qū)域順式調(diào)節(jié)其鄰近的蛋白質(zhì)編碼基因（圖4b），此外也獲得了7616個(gè)反式調(diào)節(jié)的lncRNAs。為了清楚地展示反式調(diào)控關(guān)系，作者將差異表達(dá)程度較大的前35個(gè)lncRNA和蛋白編碼基因顯示出來(圖4c)。結(jié)合lncRNA-mRNA，miRNA-mRNA和miRNA-lncRNA分析，在用Pearson相關(guān)系數(shù)（PCC）（絕對(duì)值> 0.9）篩選后，觀察到7個(gè)順式，59個(gè)反式和2個(gè)miRNA調(diào)控關(guān)系（圖4d）。具有順式調(diào)控關(guān)系的lncRNA和蛋白質(zhì)編碼基因的PCC為正，而具有lncRNA及其反式調(diào)控的蛋白質(zhì)編碼基因的PCC為負(fù)（圖4e）。

由于印跡基因在生長(zhǎng)發(fā)育中非常重要，所以作者基于240個(gè)印跡基因進(jìn)行了進(jìn)一步分析（圖4f），這些印跡基因與FGR呈顯著負(fù)相關(guān)，其中有6個(gè)印跡基因在FGR組和對(duì)照組間差異表達(dá)，如Col9a3，Dlk1，Fuca1，Lilrb4，Sfrp2和Ventx（圖4i）。這些結(jié)果觀察到一簇印跡基因與FGR相關(guān)可能為FGR提供了潛在的標(biāo)志物。

圖4 FGR的核心調(diào)控網(wǎng)絡(luò)和印跡基因

 5、關(guān)鍵基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)模塊與FGR密切相關(guān)

為了闡述FGR中重要的基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)，作者進(jìn)行了WGCNA并將FGR和對(duì)照組進(jìn)行了全轉(zhuǎn)錄組聚類（圖5a）。所有的這些基因聚為18個(gè)模塊，大部分基因聚類在綠松石色模塊，富集于中性粒細(xì)胞脫顆粒（圖5b）。皮爾遜相關(guān)系數(shù)分析了網(wǎng)絡(luò)模塊和樣品性狀間的關(guān)系，結(jié)果顯示綠松石和紫色模塊與出生重量顯著正相關(guān)，而綠松石和午夜藍(lán)模塊在FGR組和對(duì)照組間顯著差異（圖5c）。模塊的穩(wěn)定性分析表明前四個(gè)模塊，包括綠松石，藍(lán)色，棕色，和黃色模塊都展示出較高的穩(wěn)定性（圖5d）。層次聚類分析表明綠松石模塊與出生重量顯著相關(guān)并且可以明顯區(qū)分FGR組和對(duì)照組（圖5e）。GO富集和通路分析表明綠松石模塊主要富集于腫瘤中破骨細(xì)胞分化和癌癥中轉(zhuǎn)錄失調(diào)（圖5f）。這些結(jié)果表明關(guān)鍵模塊綠松石與FGR顯著相關(guān)，但是模塊中的基因的進(jìn)一步大樣本驗(yàn)證研究將有助于為FGR提供更多的證據(jù)。

圖5 關(guān)鍵基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)模塊與FGR密切相關(guān)

 6、蛋白質(zhì)編碼基因、lncRNA和miRNAs作為FGR的潛在標(biāo)記

作者對(duì)轉(zhuǎn)錄組中的差異表達(dá)基因進(jìn)行了qRT-PCR驗(yàn)證包括兩個(gè)印跡基因（Sfrp2 and Dlk1），一個(gè)蛋白編碼基因Slpi，5個(gè)lncRNAs（圖6a）。ROC曲線顯示，RP11_552M6.1、LINC01291、Asgr1的曲線下面積(AUC)值可達(dá)到0.958，表明具有顯著預(yù)測(cè)FGR的潛力（圖6b）。為了觀察其在臨床應(yīng)用的潛力，檢測(cè)了12對(duì)FGR病例和對(duì)照產(chǎn)婦外周血標(biāo)本中差異表達(dá)分子的表達(dá)水平。ROC曲線表明Sfrp2、miR-432-5p、miR- 1306-3p在FGR產(chǎn)婦外周血中的表達(dá)模式具有顯著的預(yù)測(cè)能力(AUC = 0.882)（圖6c）。這些結(jié)果表明這些蛋白編碼基因，lncRNAs，miRNAs都與FGR密切相關(guān)，并且可能為FGR提供潛在的標(biāo)志物。

圖6蛋白質(zhì)編碼基因、lncRNA和miRNAs作為FGR的潛在標(biāo)記

總之，這項(xiàng)研究全面剖析了人類臍帶血的轉(zhuǎn)錄組全貌，構(gòu)建了核心基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)，描繪了包括與FGR相關(guān)的印跡基因在內(nèi)的關(guān)鍵基因特征，并提供了對(duì)子宮內(nèi)擾動(dòng)和FGR候選特征的關(guān)鍵見解。 然而，在妊娠早期對(duì)大樣本量的診斷意義還需要進(jìn)一步探索，并且需要進(jìn)行功能和機(jī)理研究以為闡明FGR提供更多證據(jù)。

參考文獻(xiàn)：

Wang Guiying., Yu Jun., Yang Yiwei., Liu Xiaoqin., Zhao Xiaobo., Guo Xudong., Duan Tao., Lu Chenqi., Kang Jiuhong.(2020). Whole-transcriptome sequencing uncovers core regulatory modules and gene signatures of human fetal growth restriction. Clin Transl Med, 9(1), 9. doi:10.1186/s40169-020-0259-0