CircRNA調(diào)控腫瘤能量代謝

導(dǎo)語：有氧糖酵解，也稱為Warburg效應(yīng)，是正常細(xì)胞和惡性腫瘤細(xì)胞之間最顯著的差異。腫瘤細(xì)胞主要利用糖酵解途徑提供能量，提高逃避凋亡、侵襲和抵抗化療藥物的能力。代謝異常是惡性腫瘤的標(biāo)志之一。環(huán)狀RNA(circRNA)是一類內(nèi)源性非編碼RNA，在轉(zhuǎn)錄或轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因，執(zhí)行多種生物學(xué)功能。circRNA是否參與腫瘤的代謝轉(zhuǎn)化？

參考文獻(xiàn)：Shen, S., et al., CircECE1 activates energy metabolism in osteosarcoma by stabilizing c-Myc. Molecular cancer, 2020. 19(1): p. 151. (IF= 15.302)

技術(shù)路線：

結(jié)果：

1. CircECE1在骨肉瘤（OS）組織和細(xì)胞系中過表達(dá)

RNA免疫沉淀用于檢測OS細(xì)胞系中與c-Myc結(jié)合的circRNA，發(fā)現(xiàn)hsa_circ_0002402（CircECE1）富集最為顯著。CircECE1在OS組織中的表達(dá)高于軟骨瘤組織，肺轉(zhuǎn)移瘤中CircECE1的表達(dá)高于原發(fā)性OS組織。CircECE1在OS細(xì)胞系中的表達(dá)也高于hFOB1.19細(xì)胞系，在U2OS和143B細(xì)胞中表達(dá)最高。CircECE1由位于1號染色體上的ECE1基因生成，用收斂和發(fā)散引物、RNase R處理評估CircECE1的環(huán)狀結(jié)構(gòu)。RNA FISH檢測發(fā)現(xiàn)CircECE1主要定位于細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核。這些發(fā)現(xiàn)揭示了CircECE1在OS組織和細(xì)胞系中過表達(dá)，并定位于細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核。

2. CircECE1促進(jìn)OS細(xì)胞的遷移和增殖，調(diào)控c-Myc功能

使用CCK-8和EDU試驗(yàn)評估細(xì)胞活力，發(fā)現(xiàn)CircECE1敲除損害增殖，增強(qiáng)了凋亡率，CircECE1過表達(dá)促進(jìn)增殖，顯著降低OS細(xì)胞的遷移能力，可以通過CircECE1過表達(dá)來挽救。這些發(fā)現(xiàn)表明CircECE1在體外OS細(xì)胞的存活和增殖中發(fā)揮作用。

為確定CircECE1是否影響C-Myc功能靶基因。在CircECE1過表達(dá)和敲除細(xì)胞中分析一些已知的c-Myc靶標(biāo)（JunB、Mdm2、HIF1α、c-Jun、ELK-1和Cdc25a）的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)幾個(gè)c-Myc靶標(biāo)在CircECE1過表達(dá)的OS細(xì)胞中上調(diào)，在CircECE1敲除的OS細(xì)胞中下調(diào)。c-Myc敲低阻斷了由CircECE1過表達(dá)誘導(dǎo)的JunB、Mdm2、HIF1α、c-Jun、ELK-1和Cdc25a的上調(diào)。說明CircECE1調(diào)控c-Myc功能。

3. CircECE1與c-Myc相互作用，防止其被SPOP降解

HEK-293 T細(xì)胞與CircECE1和編碼各種c-Myc蛋白片段的載體共轉(zhuǎn)染，證明c-Myc片段2與CircECE1相互作用。CircECE1過表達(dá)導(dǎo)致細(xì)胞中c-Myc蛋白水平增加。蛋白合成抑制劑CHX處理CircECE1-WT/MUT過表達(dá)細(xì)胞，用蛋白酶體抑制劑硼替佐米處理CircECE1敲低細(xì)胞。CHX處理降低細(xì)胞中的c-Myc蛋白，CircECE1 WT細(xì)胞中c-Myc的半衰期顯著延長。硼替佐米治療逆轉(zhuǎn)CircECE1敲低誘導(dǎo)的c-Myc蛋白下降。在用NEM（內(nèi)源性去泛素化酶抑制劑）或PR-619（非選擇性去泛素化酶抑制劑）處理后，c-Myc在CircECE1敲除細(xì)胞中泛素化更多，在CircECE1過表達(dá)細(xì)胞中泛素化更少。這些表明CircECE1轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)OS細(xì)胞中c-Myc水平。

為檢測E3泛素連接酶接頭SPOP是否參與CircECE1介導(dǎo)的c-Myc表達(dá)調(diào)控，在CircECE1敲除細(xì)胞中敲除SPOP。SPOP敲除消除了CircECE1敲除誘導(dǎo)的c-Myc蛋白水平的下降。

RIP實(shí)驗(yàn)顯示CircECE1與c-Myc相互作用，但不與SPOP相互作用，Co-IP實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)CircECE1敲低增強(qiáng)了細(xì)胞中SPOP和c-Myc之間的相互作用。這些結(jié)果表明CircECE1與cMyc相互作用阻止SPOP介導(dǎo)的降解。

4. CircECE1過表達(dá)促進(jìn)Warburg效應(yīng)

研究CircECE1是否參與糖酵解和能量代謝。CircECE1失調(diào)影響參與葡萄糖攝取、糖酵解和乳酸分泌的各種關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子的表達(dá)水平，而CircECE1敲低具有相反的作用。為滿足快速增殖和轉(zhuǎn)移的需求，惡性腫瘤細(xì)胞依靠葡萄糖代謝產(chǎn)生ATP，CircECE1過表達(dá)增加細(xì)胞中ATP的產(chǎn)生，增加細(xì)胞的線粒體膜電位。在circECE1過表達(dá)細(xì)胞中，細(xì)胞外酸化率(ECAR)和耗氧率(OCR)增加。綜上所述， CircECE1在OS細(xì)胞的葡萄糖代謝中起著至關(guān)重要的作用。

5. c-Myc介導(dǎo)CircECE1在糖代謝中的功能

c-Myc敲除后，與葡萄糖代謝相關(guān)的糖酵解酶的表達(dá)不能上調(diào)。CircECE1 MUT過表達(dá)導(dǎo)致ATP生成減少。與CircECE1 WT相比，CircECE1 MUT也降低了細(xì)胞的線粒體膜電位，抑制葡萄糖攝取和乳酸生成。這些結(jié)果證實(shí)c-Myc介導(dǎo)了CircECE1在葡萄糖代謝中的功能。CircECE1 MUT顯著抑制OS細(xì)胞的增殖和集落形成能力，降低遷移能力，增強(qiáng)了細(xì)胞凋亡率。這些表明c-Myc介導(dǎo)了CircECE1在葡萄糖代謝中的功能。

6. TXNIP是OS中CircECE1的靶點(diǎn)

為確定CircECE1介導(dǎo)的糖代謝調(diào)節(jié)的分子機(jī)制，RNA-seq鑒定CircECE1過表達(dá)改變的信號通路。TXNIP是差異表達(dá)基因之一，是一個(gè)公認(rèn)的糖代謝調(diào)節(jié)因子，在一些癌細(xì)胞中受c-Myc的調(diào)控。在兩個(gè)OS細(xì)胞系中，cMyc和CircECE1敲除均顯著改變TXNIP mRNA表達(dá)，c-Myc抑制TXNIP啟動子活性，c-Myc敲低增加細(xì)胞中TXNIP蛋白水平。這些發(fā)現(xiàn)表明c-Myc阻斷TXNIP轉(zhuǎn)錄。TXNIP可抑制與葡萄糖代謝相關(guān)的糖酵解酶的表達(dá)，降低細(xì)胞的增殖。CircECE1過表達(dá)后TXNIP蛋白水平下降，TXNIP可以在體外逆轉(zhuǎn)CircECE1 WT過表達(dá)的影響，包括調(diào)節(jié)參與葡萄糖攝取、糖酵解、乳酸分泌、ATP產(chǎn)生、葡萄糖攝取、乳酸產(chǎn)生、ECAR、OCR、增殖、遷移和凋亡。TXNIP是CircECE1調(diào)節(jié)糖代謝的重要下游效應(yīng)因子。

7. CircECE1在異種移植模型中促進(jìn)腫瘤生長和轉(zhuǎn)移，增加葡萄糖利用

裸鼠皮下注射CircECE1 WT-或MUT-過表達(dá)的143B細(xì)胞。與對照或CircECE1 MUT細(xì)胞相比，CircECE1 WT細(xì)胞具有更高的腫瘤生長率，糖酵解酶的mRNA和蛋白水平在CircECE1 WT組異種移植瘤的組織中顯著上調(diào)。將同時(shí)用發(fā)光染料和GFP標(biāo)記的143B細(xì)胞注射到尾靜脈接種到肺腔，體內(nèi)生物發(fā)光成像證明CircECE1 WT促進(jìn)OS細(xì)胞原位轉(zhuǎn)移，而CircECE1 MUT細(xì)胞不能形成肺轉(zhuǎn)移。IHC測量軟骨瘤和OS患者樣本中TXNIP和糖酵解酶的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)OS中TXNIP表達(dá)降低，糖酵解酶表達(dá)增加。這些表明CircECE1通過阻止OS中SPOP降解c-Myc介導(dǎo)能量代謝。