CircRNA調(diào)控腫瘤能量代謝

導語：有氧糖酵解，也稱為Warburg效應(yīng)，是正常細胞和惡性腫瘤細胞之間最顯著的差異。腫瘤細胞主要利用糖酵解途徑提供能量，提高逃避凋亡、侵襲和抵抗化療藥物的能力。代謝異常是惡性腫瘤的標志之一。環(huán)狀RNA(circRNA)是一類內(nèi)源性非編碼RNA，在轉(zhuǎn)錄或轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因，執(zhí)行多種生物學功能。circRNA是否參與腫瘤的代謝轉(zhuǎn)化？

參考文獻：Shen, S., et al., CircECE1 activates energy metabolism in osteosarcoma by stabilizing c-Myc. Molecular cancer, 2020. 19(1): p. 151. (IF= 15.302)

技術(shù)路線：

結(jié)果：

1. CircECE1在骨肉瘤（OS）組織和細胞系中過表達

RNA免疫沉淀用于檢測OS細胞系中與c-Myc結(jié)合的circRNA，發(fā)現(xiàn)hsa_circ_0002402（CircECE1）富集最為顯著。CircECE1在OS組織中的表達高于軟骨瘤組織，肺轉(zhuǎn)移瘤中CircECE1的表達高于原發(fā)性OS組織。CircECE1在OS細胞系中的表達也高于hFOB1.19細胞系，在U2OS和143B細胞中表達最高。CircECE1由位于1號染色體上的ECE1基因生成，用收斂和發(fā)散引物、RNase R處理評估CircECE1的環(huán)狀結(jié)構(gòu)。RNA FISH檢測發(fā)現(xiàn)CircECE1主要定位于細胞質(zhì)和細胞核。這些發(fā)現(xiàn)揭示了CircECE1在OS組織和細胞系中過表達，并定位于細胞質(zhì)和細胞核。

2. CircECE1促進OS細胞的遷移和增殖，調(diào)控c-Myc功能

使用CCK-8和EDU試驗評估細胞活力，發(fā)現(xiàn)CircECE1敲除損害增殖，增強了凋亡率，CircECE1過表達促進增殖，顯著降低OS細胞的遷移能力，可以通過CircECE1過表達來挽救。這些發(fā)現(xiàn)表明CircECE1在體外OS細胞的存活和增殖中發(fā)揮作用。

為確定CircECE1是否影響C-Myc功能靶基因。在CircECE1過表達和敲除細胞中分析一些已知的c-Myc靶標（JunB、Mdm2、HIF1α、c-Jun、ELK-1和Cdc25a）的表達，發(fā)現(xiàn)幾個c-Myc靶標在CircECE1過表達的OS細胞中上調(diào)，在CircECE1敲除的OS細胞中下調(diào)。c-Myc敲低阻斷了由CircECE1過表達誘導的JunB、Mdm2、HIF1α、c-Jun、ELK-1和Cdc25a的上調(diào)。說明CircECE1調(diào)控c-Myc功能。

3. CircECE1與c-Myc相互作用，防止其被SPOP降解

HEK-293 T細胞與CircECE1和編碼各種c-Myc蛋白片段的載體共轉(zhuǎn)染，證明c-Myc片段2與CircECE1相互作用。CircECE1過表達導致細胞中c-Myc蛋白水平增加。蛋白合成抑制劑CHX處理CircECE1-WT/MUT過表達細胞，用蛋白酶體抑制劑硼替佐米處理CircECE1敲低細胞。CHX處理降低細胞中的c-Myc蛋白，CircECE1 WT細胞中c-Myc的半衰期顯著延長。硼替佐米治療逆轉(zhuǎn)CircECE1敲低誘導的c-Myc蛋白下降。在用NEM（內(nèi)源性去泛素化酶抑制劑）或PR-619（非選擇性去泛素化酶抑制劑）處理后，c-Myc在CircECE1敲除細胞中泛素化更多，在CircECE1過表達細胞中泛素化更少。這些表明CircECE1轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)OS細胞中c-Myc水平。

為檢測E3泛素連接酶接頭SPOP是否參與CircECE1介導的c-Myc表達調(diào)控，在CircECE1敲除細胞中敲除SPOP。SPOP敲除消除了CircECE1敲除誘導的c-Myc蛋白水平的下降。

RIP實驗顯示CircECE1與c-Myc相互作用，但不與SPOP相互作用，Co-IP實驗發(fā)現(xiàn)CircECE1敲低增強了細胞中SPOP和c-Myc之間的相互作用。這些結(jié)果表明CircECE1與cMyc相互作用阻止SPOP介導的降解。

4. CircECE1過表達促進Warburg效應(yīng)

研究CircECE1是否參與糖酵解和能量代謝。CircECE1失調(diào)影響參與葡萄糖攝取、糖酵解和乳酸分泌的各種關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子的表達水平，而CircECE1敲低具有相反的作用。為滿足快速增殖和轉(zhuǎn)移的需求，惡性腫瘤細胞依靠葡萄糖代謝產(chǎn)生ATP，CircECE1過表達增加細胞中ATP的產(chǎn)生，增加細胞的線粒體膜電位。在circECE1過表達細胞中，細胞外酸化率(ECAR)和耗氧率(OCR)增加。綜上所述， CircECE1在OS細胞的葡萄糖代謝中起著至關(guān)重要的作用。

5. c-Myc介導CircECE1在糖代謝中的功能

c-Myc敲除后，與葡萄糖代謝相關(guān)的糖酵解酶的表達不能上調(diào)。CircECE1 MUT過表達導致ATP生成減少。與CircECE1 WT相比，CircECE1 MUT也降低了細胞的線粒體膜電位，抑制葡萄糖攝取和乳酸生成。這些結(jié)果證實c-Myc介導了CircECE1在葡萄糖代謝中的功能。CircECE1 MUT顯著抑制OS細胞的增殖和集落形成能力，降低遷移能力，增強了細胞凋亡率。這些表明c-Myc介導了CircECE1在葡萄糖代謝中的功能。

6. TXNIP是OS中CircECE1的靶點

為確定CircECE1介導的糖代謝調(diào)節(jié)的分子機制，RNA-seq鑒定CircECE1過表達改變的信號通路。TXNIP是差異表達基因之一，是一個公認的糖代謝調(diào)節(jié)因子，在一些癌細胞中受c-Myc的調(diào)控。在兩個OS細胞系中，cMyc和CircECE1敲除均顯著改變TXNIP mRNA表達，c-Myc抑制TXNIP啟動子活性，c-Myc敲低增加細胞中TXNIP蛋白水平。這些發(fā)現(xiàn)表明c-Myc阻斷TXNIP轉(zhuǎn)錄。TXNIP可抑制與葡萄糖代謝相關(guān)的糖酵解酶的表達，降低細胞的增殖。CircECE1過表達后TXNIP蛋白水平下降，TXNIP可以在體外逆轉(zhuǎn)CircECE1 WT過表達的影響，包括調(diào)節(jié)參與葡萄糖攝取、糖酵解、乳酸分泌、ATP產(chǎn)生、葡萄糖攝取、乳酸產(chǎn)生、ECAR、OCR、增殖、遷移和凋亡。TXNIP是CircECE1調(diào)節(jié)糖代謝的重要下游效應(yīng)因子。

7. CircECE1在異種移植模型中促進腫瘤生長和轉(zhuǎn)移，增加葡萄糖利用

裸鼠皮下注射CircECE1 WT-或MUT-過表達的143B細胞。與對照或CircECE1 MUT細胞相比，CircECE1 WT細胞具有更高的腫瘤生長率，糖酵解酶的mRNA和蛋白水平在CircECE1 WT組異種移植瘤的組織中顯著上調(diào)。將同時用發(fā)光染料和GFP標記的143B細胞注射到尾靜脈接種到肺腔，體內(nèi)生物發(fā)光成像證明CircECE1 WT促進OS細胞原位轉(zhuǎn)移，而CircECE1 MUT細胞不能形成肺轉(zhuǎn)移。IHC測量軟骨瘤和OS患者樣本中TXNIP和糖酵解酶的表達，發(fā)現(xiàn)OS中TXNIP表達降低，糖酵解酶表達增加。這些表明CircECE1通過阻止OS中SPOP降解c-Myc介導能量代謝。