國自然之m6A甲基化

m6A甲基化是近些年最火熱的研究方向之一，從2014到2019，立項數(shù)目一直呈上升趨勢。

今天小編給大家介紹一篇關于m6A甲基化的文章。這篇文章發(fā)表于影響因子為8.986的molecular therapy上。本文主要探究METTL3在口腔鱗狀細胞癌(OSCC)中的作用機制。在這項研究中，我們發(fā)現(xiàn)，METTL3通過BMI1 m6A甲基化促進OSCC增殖和轉移，提示METTL3-m6A-BMI1軸可作為OSCC患者的預后生物標志物或治療靶點。
結果：

1）OSCC中m6A甲基化酶的解除

我們比較和分析了來自TCGA RNA測序數(shù)據(jù)庫的正常組織和OSCC組織中主要m6A甲基化相關修飾酶的表達水平，發(fā)現(xiàn)在OSCC中，METTL3和WTAP顯著上調(diào)，而METTL14的表達沒有變化(圖1A)。去甲基化酶(FTO或ALKBH5)和m6A相關閱讀蛋白(除YTHDF1外)未顯示出顯著變化(圖1B和1C)。為了進一步證實m6A甲基化修飾酶在OSCC的表達，在OSCC及其鄰近的正?？谇徽衬そM織中進行了qRT-PCR，結果顯示在OSCC中，METTL3、METTL14、WTAP、FTO、YTHDF1、YTHDF2和YTHDC1的表達水平明顯較高，而ALKBH5和YTHDC2的表達水平無明顯變化(圖1D-1F)。因此，我們推測OSCC病的發(fā)生可能與m6A去甲基化酶有關，尤其是METTL3的上調(diào)。

2）在OSCC，METTL3上調(diào)并與不良預后相關

為了確定METTL3在OSCC發(fā)展中的作用，在兩個OSCC隊列中進行了免疫組織化學染色。對于訓練樣本集，發(fā)現(xiàn)METTL3在細胞核中表達，其表達在正常粘膜組織中很少檢測到，但在OSCC組織中顯著(圖2A)。更高的METTL3表達水平與晚期腫瘤分期、晚期臨床分期和淋巴結轉移呈正相關(圖2B)。Kaplan-Meier分析顯示，METTL3高表達患者的總生存時間明顯短于METTL3低表達患者(圖2C)。此外，用ROC曲線評估了用于OSCC診斷的METTL3表達水平的潛在價值。如圖2D所示，METTL3的曲線下面積為0.729，靈敏度為65.3%，特異性為92%。在6對人類OSCC和鄰近的非癌樣品組織中發(fā)現(xiàn)了METTL3蛋白水平和總m6A水平之間的顯著相關性(圖2E)。

3）METTL3在體外促進OSCC細胞增殖、自我更新、遷移和侵襲

為研究METTL3在OSCC中的功能作用，利用METTL3 shRNA序列構建慢病毒，建立SCC9細胞中METTL3敲除模型。結果表明METTL3在蛋白和mRNA水平均被成功敲除(圖3A)。穩(wěn)定敲除METTL3后，SCC9細胞增殖能力呈時間依賴性下降(圖3B)，遷移和侵襲能力下降(圖3C)，減少了集落(圖3D)，形成了更少更小的球體(圖3E)。此外，我們還利用慢病毒構建了METTL3過表達系統(tǒng)，以探討METTL3在OSCC中的功能作用。在蛋白和mRNA水平上都證實了METTL3的上調(diào)(圖3F)。上調(diào)SCC9細胞中METTL3表達，增強了細胞的增殖能力(圖3G)和遷移侵襲能力(圖3H)。過表達METTL3的SCC9細胞的集落形成能力(圖3I)和成球能力(圖3J)也顯著增強。

4）METTL3在體內(nèi)促進OSCC腫瘤的生長和轉移

為了研究METTL3在體內(nèi)的促癌作用，我們將METTL3敲低細胞和非靶向shRNA對照細胞皮下注射到裸鼠體內(nèi)。如圖4A所示，METTL3穩(wěn)定敲除組形成的腫瘤的體積和重量明顯低于對照組shRNA和敲除組。移植28天后，METTL3表達抑制腫瘤生長80%。在肺轉移模型中，與注射對照shRNA感染細胞的小鼠相比，注射METTL3 shRNA感染細胞的小鼠表現(xiàn)出轉移結節(jié)數(shù)量顯著減少(圖4B)。另外，我們還將METTL3過表達細胞和模擬感染細胞注射到裸鼠皮下，發(fā)現(xiàn)METTL3過表達組的腫瘤體積和重量明顯高于對照組(圖4C)。肺轉移模型顯示，與對照組相比，METTL3的過表達導致肺轉移結節(jié)顯著增加(圖4D)。此外，在淋巴結轉移模型中(圖4E)，基因敲除導致淋巴結轉移顯著減少。METTL3過表達顯著增加淋巴結轉移。因此，我們得出結論，METTL3可能作為一個癌基因，促進OSCC生長和轉移。

5）METTL3增強了口腔的化學致癌作用

為了進一步驗證METTL3在體內(nèi)的致癌作用，我們將METTL3fl/fl小鼠與K14 CreER小鼠雜交，產(chǎn)生了一個它莫西芬介導的條件性METTL3基因KO小鼠模型。首先，為了檢查METTL3的缺失是否預防或減少4-硝基喹啉1-氧化物(4NQO)誘導的小鼠OSCC癌發(fā)生，在給予4NQO之前，給Mettl3cKO and Mettl3Ctrl小鼠注射tamoxifen。在最初的4NQO治療22周后，對小鼠實施安樂死(圖5A)。我們發(fā)現(xiàn)對照組小鼠以100%外顯率(6/6)發(fā)展為OSCC，并且僅有33.3% (2/6)的Mettl3cKO小鼠發(fā)展為輕度發(fā)育不良，這表明METTL3缺失可以降低體內(nèi)OSCC的發(fā)生率。此外，我們檢查了兩組中Ki67的表達，發(fā)現(xiàn)與對照組相比，Mettl3^cKOOSCC組中Ki67受到抑制(圖5B)。接下來，我們研究了丟失METTL3是否能抑制OSCC進程。結果表明，在Mettl3^Ctrl和Mettl3^cKO小鼠中口腔中的臨床可見病變的數(shù)目是2.9±1.0和1.25±0.7(圖5E)。值得注意的是，與對照組小鼠相比，Mettl3^cKO小鼠顯示OSCC損傷面積減少，組織病理學分級降低(圖5F和5G)。一致的是，與對照組小鼠相比，Mettl3^cKO小鼠的OSCC病變的增殖活性降低(圖5H)。這些結果表明，在OSCC形成之前或之后，METTL3的損失導致抑制小鼠口腔區(qū)域惡性腫瘤的發(fā)展。

與之互補的是，我們的腫瘤發(fā)病率研究顯示，Mettl3 KI導致小鼠早期OSCC的出現(xiàn)(圖5K)。定量分析顯示，Mettl3^cKI小鼠的病灶數(shù)量和病灶面積均高于對照組(圖5L和5M)。4NQO處理下Mettl3^cKI小鼠舌部發(fā)生OSCC的比例為46.15%，對照組舌部僅出現(xiàn)30%的OSCC形成(圖5N)。此外，與對照小鼠相比，Mettl3^cKI小鼠的增殖增加(圖5O)。這些數(shù)據(jù)表明，口腔上皮細胞中的Mettl3 KI可增強腫瘤易感性和惡性程度。

6）MeRIP-Seq/MeRIP-qRT PCR鑒定BMI1為METTL3下游靶點

為了確定OSCC的m6A分子生物學靶點，我們用OSCC細胞系HSC3進行了m6A MeRIP-seq。元基因分析顯示m6A峰主要富集在翻譯終止位點附近(圖6A)。在OSCC細胞系中鑒定出AUGGAC基序(圖6B)。GO分析顯示m6A修飾的基因在RNA轉錄和蛋白質泛素化、染色質修飾和細胞周期的調(diào)節(jié)中是豐富的(圖6C)，這表明m6A可能對OSCC有深遠的影響。可視化分析顯示m6A峰富集在BMI1基因的終止密碼子附近(圖6D)。此外，MeRIP-qRT PCR分析顯示，BMI1 m6A 修飾在敲除METTL 3后顯著降低(圖6E)，而在METTL 3過表達時升高(圖6F)，這表明在OSCC m6A修飾可以調(diào)節(jié)BMI1。

7）METTL3介導的m6A修飾促進了BMI1 mRNA的翻譯，增強了OSCC的增殖和轉移

為了研究OSCC BMI 1 m6A修飾的分子機制，我們首先在SCC9細胞中敲除了METTL3，發(fā)現(xiàn)METTL3的敲除降低了BMI1蛋白的表達，而沒有改變其基因水平(圖7A和7B)，這表明METTL3可以在轉錄后水平調(diào)節(jié)BMI1的表達。事實上，敲除METTL3顯著降低了BMI1基因在主動翻譯的多聚體部分中的比例(圖7C)，但對其基因穩(wěn)定性和蛋白質降解率幾乎沒有影響(圖7D-7F)，這表明METTL3介導的m6A修飾是BMI1基因有效翻譯所必需的。同時，我們發(fā)現(xiàn)在SCC9細胞中過表達METTL3增加了BMI1蛋白的表達(圖7G)，但沒有增加其mRNA水平(圖7H)。METTL3過表達增加了多聚體結合BMI1基因的水平(圖7I)，但沒有改變BMI1基因的穩(wěn)定性或蛋白質降解率(圖7J–7L)。因此，這些數(shù)據(jù)揭示了在OSCC中，METTL3介導的m6A修飾促進了BMI1 mRNA的翻譯。此外，與對照組相比，BMI1的表達在Mettl3^cKO OSCC中受到抑制(圖5C和5I)，而BMI1的表達在Mettl3^cKO OSCC小鼠中與對照組相比有所增加(圖5P)。

8）METTL3識別BMI1 3’ UTR上的m6A殘基，并在與m6A reader IGF2BP1的合作下促進BMI1翻譯

為了進一步探索OSCC BMI1 m6A介導的轉錄后調(diào)控的分子機制，我們進行了熒光素酶報告子和誘變分析。如圖8A和8B所示，與用攜帶突變BMI1 3’UTR (Mut3，Mut4)的質粒轉染的細胞相比，用野生型BMI1 3’UTR轉染的細胞顯著增加了熒光素酶活性，并且與METTL3過表達質粒共轉染的細胞也顯著增加了熒光素酶活性。接著，為了了解m6A讀碼器如何在OSCC中促進BMI1翻譯，用不同siRNA的m6A讀碼器轉染SCC9細胞。如圖8C–8F所示， BMI1蛋白的表達水平在轉染IGF2BP1 siRNA的SCC9細胞中顯著降低(圖8D)。此外，IGF2BP1敲除降低了METTL3過表達SCC9細胞中BMI1蛋白水平(圖8E)。此外，敲除METTL3和/或IGF2BP1協(xié)同降低BMI1蛋白水平(圖8F)。綜上所述，在與IGF2BP1的合作下，METTL3促進了BMI1在OSCC中的翻譯。