被逼無(wú)奈的幫兇：M2巨噬細(xì)胞促進(jìn)食管癌進(jìn)展

FOXO1對(duì)于調(diào)節(jié)細(xì)胞因子和趨化因子非常關(guān)鍵，但是它在腫瘤微環(huán)境中的功能一直未能明確。在這篇文章中，作者表征了FOXO1的預(yù)后價(jià)值，以及腫瘤來(lái)源的FOXO1和M2巨噬細(xì)胞在ESCC中的相互作用。本文于2020年9月16發(fā)表在《Theranostics》IF：8.579。

技術(shù)路線(xiàn)：

主要實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下：

1、過(guò)表達(dá)FOXO1預(yù)示ESCC的不良預(yù)后和高M2巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)

52對(duì)ESCC病人樣本中檢測(cè)FOXO1的表達(dá)，結(jié)果顯示腫瘤組織中顯著高于對(duì)照，隨后在144例樣本中驗(yàn)證了該結(jié)果。生存曲線(xiàn)表明FOXO1高表達(dá)與患者不良預(yù)后相關(guān)（圖1A-C）。

隨后使用RNA測(cè)序從三株ESCC腫瘤中鑒定到22種免疫細(xì)胞浸潤(rùn)，其中CD4記憶檢測(cè)T細(xì)胞，M2巨噬細(xì)胞，和單核細(xì)胞在ESCC中的浸潤(rùn)水平最高（圖1D）。但是TCGA和實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分析顯示，免疫細(xì)胞中只有M2巨噬細(xì)胞標(biāo)志物CD206在FOXO1高表達(dá)組顯著上調(diào)，隨后組織（圖1E-F）。腫瘤組織的病理評(píng)估揭示更多的巨噬細(xì)胞，尤其是CD206陽(yáng)性的巨噬細(xì)胞，會(huì)在腫瘤高表達(dá)FOXO1的腫瘤間質(zhì)邊緣浸潤(rùn)（圖1G-H）。

圖1在ESCC病人中，過(guò)表達(dá)FOXO1與較差的生存結(jié)果和高M2巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)相關(guān)

 2、FOXO1促進(jìn)M2巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)異種腫瘤

作者將FOXO1(+)和FOXO1(-)腫瘤細(xì)胞注射于裸鼠兩側(cè)，3周后取腫瘤進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果顯示FOXO1(+)組的M2巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)水平顯著高于FOXO1(-)組。此外，CD68在FOXO1(+)腫瘤組織中過(guò)表達(dá)，提示腫瘤來(lái)源的FOXO1在體內(nèi)可促進(jìn)巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)。FOXO1(+)腫瘤組織中浸潤(rùn)的巨噬細(xì)胞主要為CD206陽(yáng)性。

圖2 M2巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)小鼠模型

 3、FOXO1調(diào)節(jié)CCL20的表達(dá)

此前的研究表明，TNF-α刺激FOXO1過(guò)表達(dá)會(huì)顯著放大NF-κB依賴(lài)的CCL20的產(chǎn)生。此外，CCR6是CCL20的受體，在多種髓細(xì)胞系表達(dá)，包括巨噬細(xì)胞。所以進(jìn)一步研究FOXO1是否影響CCL20的表達(dá)，結(jié)果顯示在FOXO1(+)的腫瘤細(xì)胞中CCL20上調(diào)表達(dá)，干擾FOXO1則CCL20的表達(dá)下調(diào)（圖3A-D）。

4、FOXO1(+)的腫瘤細(xì)胞通過(guò)CCL20分泌促進(jìn)M2巨噬細(xì)胞募集

作者發(fā)現(xiàn)當(dāng)與FOXO1(+)的腫瘤細(xì)胞孵育后M2巨噬細(xì)胞的遷移顯著增加了（圖3E）。隨后用CCL20的重組蛋白處理M2巨噬細(xì)胞發(fā)現(xiàn)其遷移也顯著增加，但是使用CCL20的抗體預(yù)處理后則M2巨噬細(xì)胞的遷移降低了。與此一致，干擾FOXO1(+)的后M2巨噬細(xì)胞的遷移也顯著下降（圖3E-G）。這些結(jié)果表明FOXO1是通過(guò)分泌CCL20介導(dǎo)M2巨噬細(xì)胞遷移。

圖3 FOXO1(+)腫瘤細(xì)胞通過(guò)分泌CCL20促進(jìn)M2巨噬細(xì)胞募集

 5、FOXO1(+)腫瘤細(xì)胞促進(jìn)M0巨噬細(xì)胞向M2巨噬細(xì)胞極化

作者構(gòu)建了ESCC腫瘤細(xì)胞與M0巨噬細(xì)胞的共培養(yǎng)系統(tǒng)，流式檢測(cè)結(jié)果顯示當(dāng)兩者共培養(yǎng)時(shí)M2巨噬細(xì)胞的組分（CD163+/CD68+）顯著增加了（圖4A）。相反，敲除FOXO1則M2極化顯示受損（圖4B）。為了全面評(píng)估誘導(dǎo)M2巨噬細(xì)胞極化表型，分析了其標(biāo)志物的表達(dá)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)FOXO1誘導(dǎo)的M2巨噬細(xì)胞顯著高表達(dá)CD206, CD163, IL10, CCL18, CLEC7A,和STAT6（圖4C）。而GSEA結(jié)果顯示FOXO1誘導(dǎo)的M0巨噬細(xì)胞具有與IL-4刺激的M2巨噬細(xì)胞類(lèi)似的分子特征（圖4D-E）。表明FOXO1誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞都是M2巨噬細(xì)胞。

6、CSF-1介導(dǎo)FOXO1誘導(dǎo)的M0巨噬細(xì)胞極化

CCL20是作者發(fā)現(xiàn)的FOXO1誘導(dǎo)M0巨噬細(xì)胞向M2極化的第一個(gè)細(xì)胞因子，但是作者發(fā)現(xiàn)CCL20并不能顯著影響M2巨噬細(xì)胞標(biāo)志物的表達(dá)。于是作者依據(jù)前人的研究猜測(cè)CSF-1可能也在M2巨噬細(xì)胞分化中扮演了重要作用。結(jié)果表明CSF-1在FOXO1(+)腫瘤細(xì)胞中顯著上調(diào)（圖4F-H）。隨后還發(fā)現(xiàn)，沉默FOXO1后CSF-1的過(guò)表達(dá)顯著減少了，并且FOXO1抗體顯著參與了CSF-1啟動(dòng)子的片段的富集（圖4FI-J）。隨后，將FOXO1(+)腫瘤細(xì)胞與M0巨噬細(xì)胞在CSF-1抗體存在的情況下進(jìn)行共培養(yǎng)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，CD163+/CD68+的比例顯著下降，而CSF-1刺激后CD206，CD163和CCL18的表達(dá)顯著上調(diào)，CD163+/CD68+的比例也顯著升高（圖4K-L）。

圖4 FOXO1(+)腫瘤細(xì)胞通過(guò)產(chǎn)生CSF-1促進(jìn)M0巨噬細(xì)胞向M2巨噬細(xì)胞極化

 7、FOXO1通過(guò)M2巨噬細(xì)胞介導(dǎo)FAK/PI3K/AKT信號(hào)促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖和遷移

M2巨噬細(xì)胞分泌腫瘤促進(jìn)因子，包括Arg-1，TGF-b和CCL18，這些都與腫瘤進(jìn)展相關(guān)。為了探究M2巨噬細(xì)胞對(duì)腫瘤的促進(jìn)作用，作者將M2的條件培養(yǎng)基與ESCC腫瘤細(xì)胞共培養(yǎng)，結(jié)果顯示其顯著促進(jìn)ESCC細(xì)胞的增殖和集落形成（圖5A-B）。進(jìn)一步在體內(nèi)驗(yàn)證其促腫瘤作用，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與對(duì)照相比，M2條件培養(yǎng)基處理過(guò)的ESCC細(xì)胞的成瘤更大（圖5D）。接著作者探究了M2促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)的通路。結(jié)果顯示，M2調(diào)節(jié)培養(yǎng)基處理過(guò)后，增強(qiáng)了FAK，PI3K和 AKT的磷酸化（圖5E）。為了驗(yàn)證M2介導(dǎo)的激活，使用PI3K抑制劑LY294002阻斷結(jié)果發(fā)現(xiàn)AKT的激活被顯著抑制（圖5F）。LY294002處理后經(jīng)M2條件培養(yǎng)基誘導(dǎo)的集落形成，細(xì)胞活力和增殖都顯著減少了（圖5G）。這些結(jié)果表明M2巨噬細(xì)胞激活了FAK/PI3K/AKT通路促進(jìn)腫瘤增殖。

據(jù)報(bào)道CCL18參與了多種癌癥的FAK/PI3K/AKT通路和上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，因此，收集M0，M2和FOXO1(+)/(-)誘導(dǎo)的M0巨噬細(xì)胞以檢測(cè)CCL18的濃度。結(jié)果顯示，M2巨噬細(xì)胞中CCL18的表達(dá)顯著上調(diào)（圖J）。此外，CCL18重組蛋白能激活FAK/PI3K/AKT通路（圖K）?？傊M管M2巨噬細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞間的相互影響較為復(fù)雜，但是這些結(jié)果表明由M2巨噬細(xì)胞分泌的CCL18是其相互關(guān)聯(lián)的因子之一。

圖5 M2巨噬細(xì)胞通過(guò)FAK/PI3K/AKT信號(hào)通路促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖和遷移

參考文獻(xiàn)：

Wang Ying., Lyu Zhaojie., Qin Yanru., Wang Xia., Sun Liangzhan., Zhang Yu., Gong Lanqi., Wu Shayi., Han Shuo., Tang Ying., Jia Yongxu., Kwong Dora Lai-Wan., Kam NgarWoon., Guan Xin-Yuan.(2020). FOXO1 promotes tumor progression by increased M2 macrophage infiltration in esophageal squamous cell carcinoma. Theranostics, 10(25), 11535-11548. doi:10.7150/thno.45261