3D培養(yǎng)模型助力癌癥機(jī)制的真實(shí)揭示

癌細(xì)胞重新連接代謝網(wǎng)絡(luò)，以提供細(xì)胞分裂和快速生長(zhǎng)所需的能量和生物合成中間體的穩(wěn)定來(lái)源。然而，這會(huì)導(dǎo)致產(chǎn)生毒性代謝副產(chǎn)物，包括活性氧(ROS)，可促進(jìn)氧化應(yīng)激并損害癌細(xì)胞活力。因此，選擇上調(diào)氧化應(yīng)激防御程序的腫瘤細(xì)胞來(lái)克服氧化應(yīng)激的毒性，這是阻礙腫瘤起始和進(jìn)展的一個(gè)重大障礙，轉(zhuǎn)錄因子NRF2是氧化應(yīng)激反應(yīng)中細(xì)胞氧化還原穩(wěn)態(tài)的主要調(diào)節(jié)因子。NRF2激活可誘導(dǎo)抗氧化劑以及谷胱甘肽(GSH)合成相關(guān)酶的表達(dá)，并通過調(diào)節(jié)磷酸戊糖和絲氨酸生物合成途徑中的酶促進(jìn)煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸的生成。穩(wěn)態(tài)條件下，NRF2通過直接結(jié)合KEAP1在蛋白水平受到嚴(yán)格控制。值得注意的是，在多種類型的人類癌癥中經(jīng)常觀察到誘導(dǎo)NRF2組成性激活的NFE2L2（編碼NRF2的基因）、KEAP1或CUL3突變。NRF2過度激活與較差的臨床預(yù)后相關(guān)，表明NRF2過度激活的癌細(xì)胞具有競(jìng)爭(zhēng)適合性優(yōu)勢(shì)。然而，NRF2過度激活賦予腫瘤細(xì)胞生存和增殖優(yōu)勢(shì)的分子機(jī)制仍不明確。近期，哈佛醫(yī)學(xué)院細(xì)胞生物學(xué)系Brugge教授及其團(tuán)隊(duì)利用肺鱗癌3D球體模型偶聯(lián)CRISPR-Cas9篩選，研究了NRF2過度激活介導(dǎo)的分子發(fā)病機(jī)制，為NRF2誘導(dǎo)的表型變化提供了關(guān)鍵的見解，相關(guān)文章以“3D Culture Models with CRISPR Screens Reveal Hyperactive NRF2 as a Prerequisite for Spheroid Formation via Regulation of Proliferation and Ferroptosis”為題發(fā)表在Molecular Cell雜志上，雜志影響因子15.584。

技術(shù)路線：

結(jié)果：

1、與2D單層細(xì)胞模型相比，肺癌細(xì)胞的3D球體模型更依賴于NRF2進(jìn)行存活和增殖

為了檢測(cè)NRF2下調(diào)在傳統(tǒng)的2D單層和3D球體培養(yǎng)中的作用，作者建立了A549和H1437非小細(xì)胞肺腫瘤細(xì)胞系，在多西環(huán)素的控制下表達(dá)兩種不同的、可誘導(dǎo)的靶向NRF2 mRNA的shRNAs，發(fā)現(xiàn)與2D單層培養(yǎng)相比，NRF2下調(diào)導(dǎo)致3D培養(yǎng)中細(xì)胞數(shù)量顯著減少（圖A），且發(fā)現(xiàn)H1437和A549細(xì)胞中細(xì)胞數(shù)量減少程度的差異與NRF2表達(dá)和NRF2活性的降低有關(guān)（圖B）。在3D培養(yǎng)中生長(zhǎng)8天（即早期階段）后，NRF2敲低的球體比沒有敲低的球體?。▓DC，D）。此外，在NRF2敲除的球體中，細(xì)胞增殖標(biāo)記物Ki67的免疫熒光染色也降低（圖C，E），表明NRF2調(diào)控3D培養(yǎng)球體的增殖。在3D培養(yǎng)中生長(zhǎng)12天（即晚期）后，NRF2敲除誘導(dǎo)A549球體中內(nèi)部基質(zhì)剝奪細(xì)胞的死亡（圖F–I），表明NRF2控制了球體形成晚期內(nèi)基質(zhì)剝奪細(xì)胞的存活。NRF2敲除誘導(dǎo)的表型是靶向的，因?yàn)閟hNRF2不能靶向NFE2L2突變體（NRF2*和NRF2**）（圖J–N）。

2、肺癌球體需要高NRF2活性

為了獲得NRF2基因標(biāo)記，作者在癌癥基因組圖譜(TCGA)項(xiàng)目中挖掘了NRF2通路中具有頻繁基因改變的四種癌癥類型（LUSC、LUAD、頭頸部鱗狀細(xì)胞癌和宮頸鱗狀細(xì)胞癌）的主要患者數(shù)據(jù)，鑒定了1466個(gè)基因，這些基因在NRF2通路中有NRF2過度激活基因改變（NFE2L2突變/擴(kuò)增或KEAP1或CUL3突變/缺失）的腫瘤中的表達(dá)顯著高于或低于無(wú)NRF2過度激活基因改變的腫瘤（圖A），獲得了55基因的NRF2簽名(圖B，2C)。NRF2標(biāo)記基因的中位數(shù)標(biāo)準(zhǔn)化表達(dá)值被用作“NRF2評(píng)分”，作為一組癌細(xì)胞系NRF2過度激活的指標(biāo)(圖C)。與3D培養(yǎng)的NRF2敲低數(shù)據(jù)一致，NRF2評(píng)分較低的肺癌細(xì)胞系不能有效形成球體，表明肺癌細(xì)胞系的NRF2評(píng)分與球體大小相關(guān)（圖D，E）。值得注意的是，在NRF2途徑中沒有基因改變但表現(xiàn)出較高NRF2評(píng)分的細(xì)胞系（即H520和SK-MES-1細(xì)胞）形成了球體，在NRF2途徑中有基因改變但表現(xiàn)出較低NRF2評(píng)分的細(xì)胞系（即H23細(xì)胞）沒有形成球體。有趣的是，一小部分表現(xiàn)出中間NRF2評(píng)分的H596細(xì)胞形成了球體，但表現(xiàn)出很強(qiáng)的內(nèi)部細(xì)胞清除率（圖D）。因此，高NRF2活性對(duì)于瘤球體形成是必要的，至少在肺癌細(xì)胞系中是如此。

為進(jìn)一步研究NRF2過度激活對(duì)球體形成的影響，作者通過CRISPR-Cas9證實(shí)KEAP1敲除增加了NRF2蛋白的表達(dá)和活性（圖F），且KEAP1敲除增加了兩種細(xì)胞系中球體的大?。▓DG–J），減輕了H596細(xì)胞中內(nèi)球體細(xì)胞的死亡（圖I和J），表明高NRF2活性可以促進(jìn)肺癌細(xì)胞中高效的球體形成。

3、抗氧化劑不能挽救NRF2下調(diào)引起的增殖缺陷

鑒于NRF2調(diào)節(jié)細(xì)胞抗氧化序，作者研究了2D與3D培養(yǎng)條件下的細(xì)胞氧化還原狀態(tài)。相對(duì)于2D培養(yǎng)，3D培養(yǎng)顯示ROS水平增強(qiáng)和GSH/GSH二硫化物(GSSG)水平降低（圖A，B），表明與單層細(xì)胞相比，球體細(xì)胞受到更多的氧化應(yīng)激。接下來(lái)用抗氧化劑NAC或GSH-EE處理，發(fā)現(xiàn)NRF2敲除后A549和H1437球體模型內(nèi)部細(xì)胞的存活率顯著增加（圖C-E）。相反，基于Ki67信號(hào)或H1437球體的大小，這些抗氧化劑并不能挽救NRF2缺失導(dǎo)致的球體增殖抑制（圖F–H），表明抗氧化劑反應(yīng)不足以促進(jìn)NRF2介導(dǎo)的球體增殖。因此，這些結(jié)果表明NRF2通過不同的機(jī)制調(diào)節(jié)肺癌球體中內(nèi)部細(xì)胞的存活和增殖。

4、CRISPR-Cas9篩選NRF2過度激活誘導(dǎo)球體生長(zhǎng)的關(guān)鍵基因

為了確定介導(dǎo)NRF2過度激活誘導(dǎo)球體生長(zhǎng)的關(guān)鍵基因和/或程序，在A549和H1437細(xì)胞中進(jìn)行了CRISPR-Cas9篩選，選擇最有可能在NRF2過度活化的腫瘤中發(fā)揮作用的基因，即與人類腫瘤中NRF2過度活化的基因改變顯著相關(guān)的基因（A），通過去除肺腫瘤或KEAP1/CUL3/NFE2L2改變的細(xì)胞系中低水平表達(dá)的基因和與NFE2L2共擴(kuò)增或與KEAP1/CUL3共缺失的基因，繪制列表（圖B），總計(jì)14058個(gè)sgRNA靶向大約1500個(gè)基因（圖B）。作者在2D和3D培養(yǎng)條件下同時(shí)在A549和H1437細(xì)胞中進(jìn)行合并的CRISPR-Cas9篩選（圖C），與2D培養(yǎng)條件相比，3D條件下兩種細(xì)胞系中富集或耗盡（D）。值得注意的是，在3D培養(yǎng)條件下最一致和顯著的命中表示更大的依賴性，包括富集靶向TSC1的sgRNA和耗盡靶向GPX4的sgRNA。

5、鐵死亡對(duì)瘤球體增殖和內(nèi)部細(xì)胞存活的影響

A549和H1437細(xì)胞中最顯著的脫落打擊是GPX4，形成球體后，用GPX4抑制劑ML210處理的球體顯示A549、H1437和H520細(xì)胞內(nèi)腔空間的細(xì)胞存活率下降（圖A，B）。為了闡明與NRF2敲除球體內(nèi)部細(xì)胞死亡是否由鐵死亡介導(dǎo)，在Fer-1（鐵死亡抑制劑）存在的情況下培養(yǎng)A549和H1437球體，發(fā)現(xiàn)Fer-1處理阻止NRF2敲除球體內(nèi)部細(xì)胞死亡（圖C，D），提示NRF2通過保護(hù)鐵死亡調(diào)節(jié)內(nèi)部細(xì)胞存活，然而用Fer-1處理球體并不能增加球體大?。▓DE–G），這表明NRF2介導(dǎo)的增殖調(diào)控并不涉及對(duì)鐵死亡。NRF2敲除增加了A549和H1437球體中H2O2的水平（圖H），表明NRF2通過降低細(xì)胞ROS水平抑制脂質(zhì)過氧化。值得注意的是，通過BODIPY測(cè)定發(fā)現(xiàn)NRF2敲低以及ML210處理顯著增加了球體內(nèi)部的脂質(zhì)過氧化物水平（圖I，J），表明球體內(nèi)部細(xì)胞容易受到脂質(zhì)過氧化的影響，NRF2能調(diào)節(jié)球體的脂質(zhì)過氧化。NRF2敲除沒有增加細(xì)胞內(nèi)Fe2+和ACSL4的表達(dá)水平，（圖K，L），表明NRF2敲除的細(xì)胞對(duì)鐵死亡的敏感性增加不是由于Fe2+或ACSL4。這些結(jié)果表明NRF2通過球體中抗氧化劑依賴的途徑調(diào)節(jié)內(nèi)部細(xì)胞的存活。

6、NRF2和GPX4之間的關(guān)系

作者檢測(cè)了NRF2下調(diào)細(xì)胞中的GPX4水平，發(fā)現(xiàn)在2D和3D培養(yǎng)條件下，NRF2下調(diào)顯著增加了GPX4水平（圖A，B）。作者通過等壓串聯(lián)質(zhì)量標(biāo)簽(TMT)標(biāo)記結(jié)合液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(LC-MS/MS)分析（圖C），發(fā)現(xiàn)大多數(shù)檢測(cè)到的硒蛋白在NRF2下調(diào)后表現(xiàn)出表達(dá)增加（圖D，E）。這表明NRF2敲除后GPX4的表達(dá)增加并不是特有的。相反，TXNRD1，一個(gè)真正的NRF2靶基因，在NRF2敲除后強(qiáng)烈降低，即使TXNRD1也是一種硒蛋白（圖E），推測(cè)NRF2敲低細(xì)胞中TXNRD1蛋白水平的降低會(huì)增加其他硒蛋白的硒利用空間，導(dǎo)致增加硒蛋白的表達(dá)。

7、靶向NRF2和GPX4導(dǎo)致肺癌球體中大量細(xì)胞死亡

鑒于球體細(xì)胞表現(xiàn)出更高水平的脂質(zhì)過氧化，作者觀察到NRF2下調(diào)增加GPX4的表達(dá)，球體內(nèi)外細(xì)胞可能具有不同的氧化應(yīng)激能力，用ML210處理NRF2敲除的球體導(dǎo)致球體內(nèi)部和外部細(xì)胞死亡（圖A，B）。接下來(lái)研究了NRF2下調(diào)聯(lián)合GPX4活性抑制在3D培養(yǎng)中是否具有特異性致死性，或者這種組合在2D培養(yǎng)條件下是否也對(duì)細(xì)胞具有致死性，發(fā)現(xiàn)A549細(xì)胞即使在2D培養(yǎng)條件下無(wú)基因操作也對(duì)ML210敏感，而H1437、H520和SK-MES-1細(xì)胞不太敏感或不敏感（圖C，左圖）。在2D培養(yǎng)中，NRF2下調(diào)使A549、H1437、H520和SK-MES-1細(xì)胞對(duì)ML210輕微敏感（圖C，左圖）。在3D培養(yǎng)中，shNRF2的誘導(dǎo)使細(xì)胞對(duì)ML210更敏感（圖C，右圖）。在2D和3D培養(yǎng)條件下，與Fer-1共同處理可完全挽救對(duì)ML210的敏感性（圖D，E）。KEAP1敲除增強(qiáng)了ML210處理的H596細(xì)胞中球體內(nèi)部細(xì)胞的存活率（圖D），這揭示了NRF2在NRF2過度活化的肺癌細(xì)胞系中的作用。作者評(píng)估了NRF2和GPX4聯(lián)合缺失是否加劇了脂質(zhì)過氧化以增強(qiáng)細(xì)胞死亡（圖F，G），在shGFP轉(zhuǎn)導(dǎo)的對(duì)照A549球體中，ML210處理增加了脂質(zhì)過氧化，特別是在球體內(nèi)部區(qū)域。在NRF2敲除的A549球體中，ML210處理增加了球體內(nèi)外區(qū)域的脂質(zhì)過氧化，盡管與球體外區(qū)域相比，內(nèi)區(qū)域的誘導(dǎo)更顯著。有趣的是，ML210處理的NRF2敲低球體外部的脂質(zhì)過氧化水平與無(wú)ML210處理的NRF2敲低球體和有ML210處理的shGFP球體內(nèi)部的脂質(zhì)過氧化水平相當(dāng)（圖7G）。因此，需要多種氧化應(yīng)激防御程序的聯(lián)合靶向作用來(lái)高效殺死腫瘤細(xì)胞。

結(jié)論：

1.NRF2是肺腫瘤球體增殖和存活所必需的。

2.NRF2阻止內(nèi)部基質(zhì)剝奪瘤球體的鐵死亡。

3.NRF2通過改變曬利用調(diào)控硒蛋白的表達(dá)。

4.靶向NRF2能夠有效殺死瘤球體細(xì)胞。

參考文獻(xiàn)：

Nobuaki T, Patricia C, Laura MS, et al. 3D Culture Models with CRISPR Screens Reveal Hyperactive NRF2 as a Prerequisite for Spheroid Formation via Regulation of Proliferation and Ferroptosis. Molecular Cell. 2020.