導(dǎo)語:膠質(zhì)瘤干細(xì)胞(GSC)是膠質(zhì)瘤中具有特殊增殖和分化能力的腫瘤細(xì)胞亞群,是腫瘤復(fù)發(fā)的主要原因之一,尤其在低氧條件下。外泌體是一種脂質(zhì)膜囊泡,含有蛋白質(zhì)和遺傳物質(zhì),介導(dǎo)細(xì)胞間通訊。長鏈非編碼RNA(lncRNA)參與眾多生物學(xué)過程,但其在腫瘤發(fā)生、發(fā)展中的作用仍知之甚少。缺氧GSC、外泌體及l(fā)ncRNA這些熱點(diǎn)碰撞出怎樣的火花,我們先睹為快。
參考文獻(xiàn):Li, J., et al., Hypoxic glioma stem cell-derived exosomes containing Linc01060 promote progression of glioma by regulating the MZF1/c-Myc/HIF-1α. Cancer research, 2020. (IF=9.727)
技術(shù)路線:
結(jié)果:
1. GSCs分泌的Linc01060轉(zhuǎn)移到膠質(zhì)瘤細(xì)胞
從人膠質(zhì)母細(xì)胞瘤GBM手術(shù)標(biāo)本中分離原代腫瘤細(xì)胞和膠質(zhì)瘤干細(xì)胞,流式細(xì)胞術(shù)和球體形成實(shí)驗(yàn)進(jìn)行鑒定。在正常或缺氧條件下培養(yǎng)GSCs,分別形成常氧(N-GSCs)和缺氧(H-GSCs)細(xì)胞。GBM、N-GSCs和H-GSCs的條件培養(yǎng)基處理膠質(zhì)瘤U-87細(xì)胞時(shí),發(fā)現(xiàn)GSCs的培養(yǎng)基顯著促進(jìn)細(xì)胞增殖、遷移和侵襲,尤其是H-GSCs。
為鑒定GSCs中潛在的外泌體相關(guān)lncRNA,使用有或無缺氧的GSCs外泌體和相應(yīng)的GBM原代細(xì)胞進(jìn)行l(wèi)ncRNA測序。鑒定出Linc01060是聚類中評分最高的非編碼RNA之一。從GSCs的培養(yǎng)基中提取外泌體,透射電子顯微鏡(TEM)、納米顆粒追蹤分析(NTA)和蛋白質(zhì)印跡法(WB)鑒定其形態(tài)、大小和表面標(biāo)記物。觀察到缺氧促進(jìn)了外泌體的釋放。
單獨(dú)用RNase A處理GSCs時(shí),條件培養(yǎng)基中Linc01060水平?jīng)]變化;但用RNase A和Triton X-100聯(lián)合處理時(shí),其水平顯著降低。同時(shí),外泌體中Linc01060的水平與條件培養(yǎng)基中相似。說明外泌體是細(xì)胞外Linc01060的主要載體。Linc01060在6種膠質(zhì)瘤細(xì)胞系中明顯上調(diào),GSCs中Linc01060的過表達(dá)或敲低分別導(dǎo)致外泌體Linc01060的上調(diào)或下調(diào)。FISH分析證明Linc01060主要位于細(xì)胞質(zhì),免疫熒光(IF)結(jié)果顯示細(xì)胞有效地吸收外泌體。這些結(jié)果表明GSC分泌的Linc01060可通過外泌體轉(zhuǎn)移到膠質(zhì)瘤細(xì)胞。
2. GSC來源的外泌體Linc01060促進(jìn)膠質(zhì)瘤的進(jìn)展
為闡明外泌體介導(dǎo)的Linc01060的生物學(xué)功能,EdU細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)、克隆形成實(shí)驗(yàn)、transwell遷移和侵襲實(shí)驗(yàn)以及動物實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證GSC來源的外泌體可以加速腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲,敲低Linc01060,外泌體不促進(jìn)這些過程。
3. Linc01060結(jié)合并穩(wěn)定MZF1蛋白
細(xì)胞質(zhì)lncRNA在翻譯或翻譯后過程中發(fā)揮調(diào)控作用。利用RNA pull-down和質(zhì)譜分析篩選Linc01060相互作用蛋白,重點(diǎn)研究RNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子髓樣鋅指1(MZF1)。RIP、pull-down試驗(yàn)證明MZF1與Linc01060的特異性結(jié)合。為驗(yàn)證Linc01060內(nèi)與MZF1結(jié)合的特定區(qū)域,創(chuàng)建了Linc01060的四個截?cái)嗥危l(fā)現(xiàn)MZF1特異性結(jié)合序列位于Linc01060基因的281-481nt長區(qū)域。
觀察到Linc01060水平的改變調(diào)節(jié)了MZF1蛋白水平,在Linc01060敲除或過表達(dá)的細(xì)胞中,MZF1 mRNA水平?jīng)]有顯著差異。因此,推測Linc01060可能穩(wěn)定MZF1蛋白。蛋白酶體抑制劑MG-132可挽救Linc01060下調(diào)導(dǎo)致MZF1蛋白水平下降的現(xiàn)象,cycloheximi追蹤試驗(yàn)顯示,MZF1在Linc01060下調(diào)的細(xì)胞中具有較短的半衰期;在過表達(dá)Linc01060的細(xì)胞中具有較長的半衰期。這表明Linc01060可能通過抑制其蛋白酶體介導(dǎo)的降解來調(diào)節(jié)MZF1。用體外泛素化實(shí)驗(yàn)探索Linc01060是否與泛素介導(dǎo)的MZF1降解有關(guān)。Linc01060的敲低增強(qiáng)了U-87 細(xì)胞和U-251細(xì)胞中MZF1蛋白的泛素化。相反,在Linc01060過表達(dá)的細(xì)胞中,泛素介導(dǎo)的MZF1降解明顯減少。這些結(jié)果表明Linc01060穩(wěn)定了MZF1蛋白,并保護(hù)其免受泛素介導(dǎo)的蛋白酶體降解。
4. Linc01060加速MZF1的核轉(zhuǎn)位,促進(jìn)MZF1介導(dǎo)的c-Myc反式激活
免疫熒光發(fā)現(xiàn)Linc01060可調(diào)節(jié)MZF1的總水平和核水平。MZF1主要定位于細(xì)胞質(zhì),少量存在于細(xì)胞核中。在Linc01060敲低細(xì)胞中,MZF1在細(xì)胞核中幾乎檢測不到,在Linc01060過表達(dá)的細(xì)胞中,細(xì)胞核中的MZF1水平顯著增加。
作為一種雙功能轉(zhuǎn)錄因子,MZF1通過與啟動子結(jié)合抑制或激活基因轉(zhuǎn)錄。MZF1與癌癥有,它轉(zhuǎn)位到細(xì)胞核并激活c-Myc,從而具有致癌作用,推測Linc01060在MZF1/c-Myc信號軸中起作用。免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)敲低Linc01060大大削弱了MZF1和c-Myc之間的相互作用。接下來探索Linc01060是否可以調(diào)節(jié)MZF1介導(dǎo)的c-Myc轉(zhuǎn)錄活性。熒光素酶報(bào)告基因檢測表明,單獨(dú)過表達(dá)MZF1及其與Linc01060的表達(dá)可增強(qiáng)轉(zhuǎn)錄活性。相關(guān)拯救實(shí)驗(yàn)表明,Linc01060和MZF1的耗竭均可導(dǎo)致c-Myc轉(zhuǎn)錄活性顯著下降。檢測參與Warburg效應(yīng)的MZF1和c-Myc靶基因的表達(dá),如HK、PGK1、LDHA、GLUT1和ENO1;發(fā)現(xiàn)Linc01060和MZF1共轉(zhuǎn)染導(dǎo)致這些基因高表達(dá);而敲低導(dǎo)致其低表達(dá)。表明Linc01060增強(qiáng)了MZF1介導(dǎo)的c-Myc轉(zhuǎn)錄活性。
5. Linc01060由缺氧誘導(dǎo),HIF-1α反式激活
研究引起膠質(zhì)瘤中Linc01060高表達(dá)的因素。c-Myc在轉(zhuǎn)錄后水平可增強(qiáng)HIF-1α的積累,保護(hù)其免受泛素介導(dǎo)的蛋白酶體降解。對Linc01060基因組序列上游~2 kb區(qū)域進(jìn)行JASPAR和UCSC分析,發(fā)現(xiàn)啟動子區(qū)有一個預(yù)測的HIF-1α結(jié)合位點(diǎn)。缺氧或CoCl2預(yù)處理1天,Linc01060和HIF-1α水平明顯升高。在常氧和低氧條件下敲低HIF-1α基因可顯著抑制Linc01060的轉(zhuǎn)錄。ChIP–qPCR、熒光素酶結(jié)果證明HIF-1α直接結(jié)合到Linc01060基因啟動子區(qū)的相同染色質(zhì)片段。這些證明Linc01060是HIF-1α的直接轉(zhuǎn)錄靶點(diǎn)。
6. Linc01060通過促進(jìn)有氧糖酵解促進(jìn)膠質(zhì)瘤進(jìn)展
生物信息學(xué)預(yù)測Linc01060可能參與腫瘤細(xì)胞的糖酵解代謝。耗氧量率(OCR)實(shí)驗(yàn)檢測Linc01060在有氧糖酵解中的作用,發(fā)現(xiàn)沉默Linc01060增加了最大呼吸,而細(xì)胞外酸化率(ECAR)曲線表明敲低Linc01060顯著降低了U-87細(xì)胞中的糖酵解、糖酵解儲備和糖酵解能力,表明Linc01060促進(jìn)糖酵解代謝。當(dāng)Linc01060下調(diào)時(shí),U-87細(xì)胞中18F-FDG攝取、乳酸生成和細(xì)胞ATP水平顯著降低。所有這些表明Linc01060可以調(diào)節(jié)膠質(zhì)瘤的糖酵解代謝。
7. Linc01060通過調(diào)節(jié)MZF1/c-Myc/HIF-1α軸促進(jìn)膠質(zhì)瘤進(jìn)展
將MZF1、c-Myc或HIF-1α質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到下調(diào)Linc01060的U-87 細(xì)胞中,顯著恢復(fù)對細(xì)胞增殖、葡萄糖攝取、乳酸生成和細(xì)胞ATP水平的抑制。證明Linc01060依賴于MZF1/c-Myc/HIF-1α信號軸調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖和有氧糖酵解。
血清外泌體Linc01060與腫瘤進(jìn)展有關(guān)為研究血清或腦脊液中外泌體Linc01060水平升高是否與膠質(zhì)瘤發(fā)生有關(guān)。從膠質(zhì)瘤患者和健康人群的血清和CSF中分離出外泌體,發(fā)現(xiàn)腫瘤患者循環(huán)外泌體中Linc01060水平較高,尤其是高級別膠質(zhì)瘤組織。腫瘤組織顯示Linc01060/MZF1/c-Myc/HIF-1α的高表達(dá),尤其是在HGG中。此外,來自血清和CSF的循環(huán)外泌體中Linc01060表達(dá)水平與膠質(zhì)瘤組織中的表達(dá)水平呈正相關(guān)。這表明膠質(zhì)瘤組織中Linc01060的上調(diào)可導(dǎo)致循環(huán)外泌體中Linc01060水平升高。臨床數(shù)據(jù)強(qiáng)烈提示循環(huán)外泌體中高水平的Linc01060與膠質(zhì)瘤進(jìn)展有關(guān)。單變量和多變量回歸分析顯示Linc01060水平是膠質(zhì)瘤患者的獨(dú)立預(yù)后指標(biāo),風(fēng)險(xiǎn)比顯著。以上表明Linc01060可能是膠質(zhì)瘤的潛在生物標(biāo)志物。