具核梭桿菌感染的結直腸癌細胞的外泌體與結直腸癌進展

瘤細胞釋放的外泌體充滿了獨特的RNA和蛋白質，它們正在成為促進腫瘤進展的通訊網絡中重要的介體。具核梭桿菌(Fusobacterium nucleatum, Fn)是結直腸癌(CRC)相關的重要細菌。到目前為止，Fn感染的CRC細胞外泌體的功能尚未被探索。今天小編給大家介紹一篇發(fā)表于影響因子為19.819的“gut”雜志上的文章“Exosomes derived from Fusobacterium nucleatum-infected colorectal cancer cells facilitate tumour metastasis by selectively carrying miR-1246/92b-3p/27a- 3p and CXCL16”，為大家介紹Fn感染的CRC細胞外泌體在結直腸癌中的作用。

在本文中，我們證明外泌體可以將miR-1246/92b- 3p/27a- 3p和CXCL16/RhoA/IL-8從Fn感染的細胞傳遞到未感染的細胞，從而增加體外細胞遷移能力，促進體內腫瘤轉移。循環(huán)外泌體miR-1246/92b-3p/27a-3p和CXCL16水平與結直腸癌患者的Fn豐度和腫瘤分期密切相關。

結果：

1）Fn感染可增加CRC細胞外泌體的分泌

為了研究CRC細胞特異性Fn感染的相關外泌體，HCT116細胞被活Fn感染后培養(yǎng)48h。然后，從Fn-感染的HCT116細胞的上清液中分離外泌體(Fn- Ex)，以未感染的HCT116細胞(Ex)和大腸桿菌感染HCT116細胞(Ec-Ex)的外泌體作為對照。透射電鏡分析顯示，純化后的囊泡樣品呈橢圓形和球形(圖1A)。NTA結果顯示，Fn-Ex的粒徑和數目略大于Ex(圖1B)。此外，通過Fn-Ex、Ex和Ec-Ex的Western blotting驗證了外泌體生物標志物(CD9和CD63)的存在(圖1C)。Fn感染顯著增加了同樣體積培養(yǎng)上清液中收集的外泌體分泌量(圖1D)。共聚焦成像顯示Fn-Ex在孵育6小時后確實被HCT16細胞吸收(圖1E，F)。這些數據表明Fn感染能增加CRC細胞外泌體的分泌量，受感染細胞能分泌略大的外泌體。

2）Fn感染細胞的外泌體促進CRC細胞的遷移

為了測定Fn-感染細胞釋放的外泌體對受體細胞的影響，我們分別用HCT116和SW480細胞孵育Fn-Ex、Ex和Ec-Ex。CCK8實驗顯示，Ec-Ex處理后，HCT116和SW480細胞表現出顯著毒性，Fn-Ex或Ex處理后，細胞表現出輕微但不顯著毒性(圖2A)。有趣的是，Fn-Ex處理的HCT116和SW480細胞形態(tài)發(fā)生明顯變化，形成紡錘形，這與Ex處理或Ec-Ex處理的細胞不同(圖2B)。此外，Transwell遷移實驗顯示，Fn-Ex處理顯著促進HCT116細胞遷移到Ex和Ec- Ex處理未觀察到的水平。SW480細胞為受體細胞時，也觀察到類似的趨勢(圖2C)。此外，劃痕實驗進一步表明，Fn-Ex處理能顯著加速HCT116和SW480細胞創(chuàng)面愈合(圖2D)。這些結果表明，來自Fn感染細胞的外泌體改變了細胞形態(tài)，促進了CRC細胞的遷移，提示Fn感染細胞的外泌體可能對受體細胞進行了重構。

3）特異性miRNA在Fn感染的CRC細胞分泌的外泌體中富集

接下來，通過miRNA-seq分析Fn-Ex和Ex的差異microRNA表達譜。從Fn-Ex和Ex中分離得到的總RNA中miRNA的百分比分別為16.55%和13.26%(圖3A)。兩組同時鑒定了282個miRNAs。兩組間重疊和獨特的miRNAs數量如圖3B所示。接下來比較Fn-Ex和Ex中miRNA的表達水平，發(fā)現兩組間有91個miRNA有顯著差異(圖3C)。與Ex比較，Fn-Ex有23個miRNA上調，1個miRNA下調(圖3D)。此外，通過RT- qPCR對Fn-Ex、Ex、Ec-Ex和K-Fn-Ex(來自Fn滅活的HCT116細胞的外泌體)中表達最高的前10個miRNA進行驗證。5種miRNA (miR-27a-3p、miR-21-5 p、miR-7704、miR-92b-3p和miR-1246)在Fn-Ex中顯著升高。與Ex、Ec-Ex和K-Fn-Ex相比，Fn感染顯著增加了三種miRNAs(miR-1246, miR- 92b- 3p和miR- 27a- 3p)的表達水平(圖3E)。這些數據表明，活Fn感染改變了CRC細胞外泌體miRNA譜，并伴隨miR-1246/92b- 3p/27a- 3p的表達增加。

4）外泌體miR-1246/92b-3p/27a-3p通過靶向GSK3β，激活Wnt/βcatenin通路，促進CRC細胞遷移

為了探究Fn感染過程中外泌體miRNAs的潛在生物學功能，我們選擇了miR-1246/92b-3p/27a-3p產生過表達(mimics)和敲除(抑制劑)miRNAs。Transwell遷移實驗顯示，與陰性對照(NC)相比，miR-1246/92b-3p/27a-3p模擬物顯著促進HCT116細胞的遷移，而三種miRNA抑制劑聯合作用可部分消除Fn-Ex介導的遷移。在SW480細胞中也觀察到類似的趨勢(圖4A)。此外，劃痕實驗顯示，與對照HCT116細胞和SW480細胞相比，miR-1246/92b-3p/27a-3p模擬物明顯促進傷口閉合，而三種抑制劑聯合使用在一定程度上挽救了Fn-Ex介導的傷口閉合率(圖4B)。

接下來，基于生物信息學分析的預測結果，我們發(fā)現miR-1246/92b- 3p/27a- 3p可以直接靶向GSK3βmRNA的3’-UTR，并且這種關聯在物種間高度保守。我們進一步生成熒光素酶報告質粒，該質粒在GSK3β的3’-UTR內含有野生型(WT)或突變型miR-1246/92b- 3p/27a-3p結合位點(圖5A-C)。如圖5D-F所示，miR-1246/92b-3p/27a-3p模擬物和Fn- Ex或抑制劑顯著抑制或增加了含有GSK3βWT 3’-UTR的報告基因的熒光素酶活性，但在突變細胞株中未觀察到抑制作用。此外，我們發(fā)現GSK3β在過表達的miR-1246/92b- 3p/27a- 3p細胞中持續(xù)下調，而在miR-1246/92b-3p/27a-3p抑制細胞中上調，這表明GSK3β可能是miR-1246/92b- 3p/27a- 3p的靶基因(圖5G)。

然后，通過Western blot檢測GSK3β和Wnt/β-catenin通路的表達。如圖6所示，與Ex處理相比，Fn-Ex處理的HCT116和SW480細胞中GSK3β水平顯著降低，而Fn-Ex處理的兩種細胞中β-catenin水平均升高。Fn-Ex處理后上皮標記物E-cadherin表達降低，間質標記物波形蛋白表達升高。Fn- Ex處理后原癌基因Cyclin D1和C- Myc表達增加。在三種miR-1246/92b- 3p/27a- 3p模擬物中也觀察到類似的結果?？傊?，這些結果表明，在Fn感染過程中，富含miR-1246/92b- 3p/27a- 3p的外泌體通過靶向GSK3β并激活Wnt/β-catenin通路誘導CRC細胞遷移。

5）Fn感染的CRC細胞外泌體蛋白的鑒定和功能分類

為了篩選Fn-Ex攜帶的特異性蛋白，用蛋白質組學方法研究Fn-Ex和Ex的差異蛋白表達譜。Venn圖分析顯示兩組間有197個蛋白重疊。Fn- Ex攜帶187個特異蛋白，其中85個Fn蛋白和102個細胞蛋白(圖7A)。KEGG通路分析顯示，核糖體、趨化因子信號通路和mTOR信號通路在這些蛋白中富集(圖7B)。眾所周知，趨化因子信號通路參與腫瘤轉移。我們進一步選擇了三種具有趨化因子信號通路的蛋白，通過免疫印跡法進行驗證。如圖7 C，與Ex相比，IL-8、CXCL1和RhoA在Fn-Ex中富集更多。有趣的是，與Ex相比，CXCL16在Fn-Ex中表現出最強的豐度。此外，WB顯示，CXCL16在Fn感染的HCT116細胞中增加(圖7 D)。Transwell遷移試驗顯示Fn-Ex促進遷移，抗CXCR6抗體治療很大程度上廢除了Fn-Ex介導的遷移(圖7E)。在傷口愈合劃痕試驗中，用抗CXCR6抗體治療也阻斷了遷移(圖7F)。這些數據表明，Fn感染可增加CRC細胞中轉移相關蛋白CXCL16的表達，CXCL16進一步被Fn-Ex選擇性包裝富集，通過CXCL16/ CXCR6軸促進腫瘤細胞遷移。

6）Fn感染細胞分泌的外泌體促進結直腸癌轉移

為了評價Fn感染外泌體對體內腫瘤轉移的潛在作用，我們在兩種小鼠結直腸腫瘤模型中評價了Fn-Ex的活性。HCT116細胞皮下注射(BALB/c裸小鼠)建立CRC移植瘤模型。給予Ex、Fn-Ex或si-Ex直到腫瘤體積達到50 mm³(圖8A)。21天后，手術切除腫瘤(圖8B)。H&E肝切片顯示，Fn-Ex組肝內血管周圍有明顯的肝內轉移，而其他三組幾乎沒有轉移跡象(圖8C，D)。此外，通過免疫組化和Western blotting分析，Fn-Ex處理組腫瘤組織中GSK3β的表達降低，而si-Ex顯著逆轉GSK3β的表達(圖8E，F)。我們還研究了Fn-Ex是否能增強CT26同種肺移植的小鼠的腫瘤轉移。靜脈給予Ex、Fn-Ex、si-Ex或PBS對照(圖8G)。與其他三組相比，Fn-Ex治療組肺表面結節(jié)數最高(圖8H，I)。H&E肺切片顯示Fn-Ex組損傷肺組織內癌巢面積最大、數量最多(圖8J)。此外，Fn- Ex給藥組肺組織中GSK3β表達降低(圖8K，L)。這些結果表明，來自Fn感染細胞的外泌體通過攜帶Fn感染特異性miRNA和蛋白在體內顯著促進腫瘤轉移。

7）miR-1246/92b-3p/27a-3p和CXCL16與結直腸癌患者臨床特征的關系

我們從結直腸癌患者和HS患者的血清中分離并鑒定外泌體。Western blots顯示，這些外泌體高度富集外泌體相關蛋白CD63和CD9(圖9A)。進一步從循環(huán)外泌體中提取RNA。我們比較了每個患者的樣本之間miR-1246/92b- 3p/27a- 3p平均值。CRC患者循環(huán)外泌體miR-1246/92b-3p/27a-3p水平明顯高于HS患者(圖9B)。此外，用qPCR檢測了82例糞便樣品中Fn的攜帶情況。采用Pearson相關系數和線性回歸分析Fn水平與循環(huán)外泌體miR-1246/92b-3p/27a-3p之間的相關性。Fn豐度與miR-1246和miR- 27a- 3p水平呈正相關，而與miR- 92b- 3p無相關性(圖9C)。此外，與HS相比，CRC患者循環(huán)外泌體CXCL16水平顯著上調(圖9D)。更重要的是，循環(huán)外泌體CXCL16與CRC患者Fn豐度呈正相關(圖9E)。這些結果表明循環(huán)外泌體miR-1246、miR- 27a- 3p和CXCL16水平在CRC患者中升高，并與腸道Fn豐度呈正相關，提示Fn水平過高可能通過釋放Fn相關外泌體促進腫瘤進展。

結論：Fn感染可能刺激腫瘤細胞產生富含miR-1246/92b-3p/27a-3p和CXCL16/RhoA/IL-8外泌體，這些外泌體并傳遞到未感染細胞以促進轉移前行為。