FGFR1信號參與k -ras驅(qū)動的腫瘤中PD-L1表達(dá)

欄目:最新研究動態(tài) 發(fā)布時間:2021-03-04
K-ras突變是驅(qū)動癌癥發(fā)展與侵襲性惡性表型相關(guān)的主要遺傳事件,而免疫檢查點(diǎn)分子PD-L1的表達(dá)在逃避免疫監(jiān)視的癌癥中起關(guān)鍵作用。

研究背景

K-ras突變是驅(qū)動癌癥發(fā)展與侵襲性惡性表型相關(guān)的主要遺傳事件,而免疫檢查點(diǎn)分子PD-L1的表達(dá)在逃避免疫監(jiān)視的癌癥中起關(guān)鍵作用。K-ras致癌信號與PD-L1表達(dá)的關(guān)系是一個需要進(jìn)一步研究的重要領(lǐng)域。文章利用K-ras驅(qū)動的腫瘤體外和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)?zāi)P脱芯恐掳┑?/span>K-ras, PD-L1表達(dá)與氧化還原調(diào)節(jié)之間的關(guān)系。(Redox Biol, IF=9.986

技術(shù)路線圖

研究結(jié)果

1.致癌k-ras的激活誘導(dǎo)PD-L1的表達(dá)

在小鼠和人胰腺癌組織中,k-ras驅(qū)動的胰腺癌組織中PD-L1的表達(dá)升高(Fig. 1A)。在T-Rex/K-ras細(xì)胞(強(qiáng)力霉素誘導(dǎo)的K-rasG12V表達(dá)細(xì)胞系統(tǒng))中檢測發(fā)現(xiàn)K-rasG12V的激活導(dǎo)致PD-L1mRNA的表達(dá)時間依賴性升高,并持續(xù)保持高水平(Fig. 1B)。WB和流式進(jìn)一步驗(yàn)證(Fig. 1CD),通過檢測其受體PD-1和另一亞基PD-L2K-rasG12V的激活導(dǎo)致PD-L1 mRNA的升高具有特異性(Fig. 1E)。

Figure 1

   

2. K-ras通過生長因子信號誘導(dǎo)PD-L1的表達(dá)

如圖2AHEK293TT-Rex/K-ras/On細(xì)胞的條件培養(yǎng)基(CM)共培養(yǎng)導(dǎo)致PD-L1的表達(dá)顯著升高,而T-Rex/K-ras/Off細(xì)胞(CM/Off)或強(qiáng)力霉素(Doxy)CM均未誘導(dǎo)PD-L1表達(dá)增加,研究顯示條件培養(yǎng)基中的分泌因子,被致癌K-ras調(diào)節(jié)從而刺激PD-L1表達(dá)。K-rasG12V導(dǎo)致EGF, FGF1, IL-1α,EGFR, FGFR1, IL1R1A 表達(dá)升高(Fig. 2B)K-rasG12V/On 細(xì)胞中EGF, FGF1IL-1α的分泌增加,EGFR FGFR1的表達(dá)升高(Fig. 2D)EGFFGF1刺激T-Rex/K-ras能夠誘導(dǎo)PD-L1的表達(dá),但是IL-1α沒有改變(Fig. 2E–G)。

EGFR 抑制劑 (Gefitinib and Afatinib) and FGFR1抑制劑(PD173074)能夠抑制K-rasG12V誘導(dǎo)的PD-L1表達(dá)(Fig. 3A)。AfatinibPD173074的作用在48小時不顯著(Fig. 3B–C)K-rasG12V激活AKT(Fig. 3B). EGFR or FGFR抑制劑不能抑制PD-L1的表達(dá)。敲除AKT1抑制T-Rex/K-ras/On細(xì)胞中PD-L1的表達(dá)(Fig. 3D)。強(qiáng)力霉素誘導(dǎo)的K-ras引起Akt磷酸化水平的持續(xù)升高(3B, D),表明K-ras激活AktPI3K抑制劑LY294002Akt抑制劑MK-2206進(jìn)一步驗(yàn)證AKTK-rasG12V誘導(dǎo)的PD-L1的表達(dá)中的作用(Fig. 3E–F)。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中,PD173074FGFR1抑制劑)能夠顯示減少Akt的活化和PD-L1的表達(dá)(Fig. 3G–H)。

Figure 2

Figure 3

3. 在胰腺癌細(xì)胞中,FGFR1K-ras誘導(dǎo)的PS-L1表達(dá)中發(fā)揮重要作用

HPNE/K-ras細(xì)胞中,PD-L1, EGFR and FGFR1 mRNA表達(dá)升高(Fig. 4A),而EGFFGF1HPNE細(xì)胞系中的表達(dá)沒有變化(Fig. 4A)WB顯示HPNE/K-ras細(xì)胞中,只有FGFR1蛋白顯著增加(4B),提示FGFR1信號通路可能是介導(dǎo)PD-L1表達(dá)的主要途徑。在Panc-1CFPAC-1細(xì)胞中,FGFEGF也能調(diào)節(jié)PD-L1的表達(dá),而在SW1990Capan-2細(xì)胞中則無此作用。敲除FGFR1,PD-L1的表達(dá)降低(Fig. 4F–H)。證明了FGFR1在胰腺癌中調(diào)節(jié)PD-L1表達(dá)的重要作用,并且PD-L1表達(dá)與FGFR1表達(dá)呈正相關(guān)

Figure 4

4.ROS介導(dǎo)K-ras誘導(dǎo)的PD-L1的表達(dá)通過FGFR1通路的激活

K-rasG12V/Off細(xì)胞經(jīng)H2O2處理,PD-L1表達(dá)顯著增加(Fig. 5A);加GLOX (葡糖氧化酶)導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)ROS上調(diào)(Fig. 5B)。ROS壓力導(dǎo)致PD-L1上調(diào)(Fig. 5C-D)??寡趸高^氧化氫酶(CAT)能將K-rasG12V/On細(xì)胞內(nèi)ROS降低到與K-rasG12V/Off細(xì)胞相當(dāng)?shù)乃?/span>(Fig. 5E),并阻止K-rasG12V誘導(dǎo)的PD-L1上調(diào)(Fig. 5F)。GLOX增加與PD-L1表達(dá)相關(guān)的FGFR1的蛋白表達(dá)(Fig. 5H)。如圖5I所示,GLOX產(chǎn)生的ROS僅能在FGFR1正常的K-rasG12V/Off細(xì)胞中增加PD-L1的表達(dá),但敲除FGFR1后,這種作用幾乎完全消失(5I)。四種人胰腺癌細(xì)胞暴露于不同濃度的H2O2 (氧化應(yīng)激)后,PDL1表達(dá)均有所增加,過氧化氫酶可以再次消除這種PD-L1的產(chǎn)生(5J)。在體外和體內(nèi)表達(dá)突變K-ras的小鼠胰腺癌模型中,抗氧化劑NAC降低了PD-L1的表達(dá)(S6I)

Figure 5

5.在免疫活性小鼠和免疫缺陷小鼠中,FGFR1敲除影響腫瘤的生長

在小鼠胰腺癌KPC細(xì)胞系(K-rasG12V/p53R172H)中敲除FGFR1 (Fig. 6A)。與人FGFR1 KO細(xì)胞系的結(jié)果一致(Fig. 4F H),敲除小鼠PDAC細(xì)胞中的FGFR1也會導(dǎo)致體外PD-L1表達(dá)下降(Fig. 6B)。FGFR1的敲除嚴(yán)重?fù)p害了KPC細(xì)胞對腫瘤生長的作用,在免疫活性C57BL/6小鼠中(Fig. 6C)。KPC細(xì)胞接種于免疫缺陷裸鼠后腫瘤生長速度更快,而敲除FGFR1僅能中度延緩裸鼠腫瘤的生長(Fig. 6D)。通過敲除FGFR1抑制PDL1表達(dá)進(jìn)一步增強(qiáng)了抗腫瘤生長的免疫功能。在裸鼠中觀察到的FGFR1缺失細(xì)胞對腫瘤生長的中度抑制(Fig. 6D)可能反映了FGFR1信號通路的缺失。對免疫小鼠分離的腫瘤組織進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn),FGFR1 KO腫瘤中PD-L1的表達(dá)降低了約30%( Fig. 6E)。由于腫瘤PD-L1的表達(dá)可能會影響T細(xì)胞的功能,因此對腫瘤組織中CD8+ T細(xì)胞浸潤進(jìn)行量化。與野生型FGFR1腫瘤相比,FGFR1 KO1FGFR1 KO2腫瘤中浸潤性T細(xì)胞數(shù)量顯著增加,分別增加了1.85倍和1.41(Fig. 6F)。持續(xù)效應(yīng)T細(xì)胞標(biāo)記基因的表達(dá)在FGFR1 KO腫瘤顯著增加,IFN,顆粒酶B和穿孔素 (Fig. 6 G- I)。這些數(shù)據(jù)表明, 體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中,在K-ras驅(qū)動的的癌細(xì)胞中,敲除FGFR1減少PDL1的表達(dá),促進(jìn)免疫反應(yīng),從而抑制腫瘤的生長。

Figure 6

 

總結(jié):

1.在體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)中, 致癌k-ras上調(diào)PD-L1的表達(dá)

2.ROS在調(diào)節(jié)k-ras誘導(dǎo)的FGFR1的激活中發(fā)揮重要作用。

3.K-ras成熟癌細(xì)胞中,抗氧化酶能夠調(diào)節(jié)PD-L1的表達(dá)

4.抑制FGFR1的表達(dá)增強(qiáng)CD8+T細(xì)胞的浸潤和抑制腫瘤生長