抑制自噬增強了Nrf2促進(jìn)小鼠糖尿病心肌炎

研究背景：

Nrf2能夠改善或加重糖尿病心肌病，但是其潛在的機制卻沒有報道。Huimei Zang的等人在Diabetes（IF=7.72）這一雜志中發(fā)表文章，介紹Nrf2介導(dǎo)的1型糖尿病心肌損傷的新機制。

技術(shù)路線圖：

研究結(jié)果：

1.心臟Nrf2在一型糖尿病伴心肌癥中的調(diào)節(jié)作用

Nrf2敲除的小鼠中糖尿病相關(guān)死亡增加，而Nrf2KO改善空腹血糖和糖尿病相關(guān)體重的減少(Fig. 1A)。糖尿病發(fā)病6個月，Nrf2KO不影響心肌癥紊亂的發(fā)生，但是減輕9月的病情進(jìn)展(Fig. 1C)。另外，心肌肥大，細(xì)胞死亡，纖維化和氧化應(yīng)激在中期和早期階段能夠被Nrf2KO所緩解(Fig. 2)。Nrf2KO小鼠2月-11月中出現(xiàn)病理性心臟生長比WT小鼠中較輕。為了避免其他因素干擾，比較了FS，BM和心臟重量/脛骨比例的變化?？偟膩碚f，Nrf2對一型糖尿病和相關(guān)死亡起到總體保護(hù)作用。但是它對糖尿病伴有心肌癥的發(fā)展并沒有保護(hù)或者延遲作用。相反，它可能以性別非依賴方式促進(jìn)疾病的發(fā)展。在分子水平上，Nrf2可能增強糖尿病心臟的氧化壓力，從而促進(jìn)糖尿病心肌癥的發(fā)展。

Fig.1

Fig.2

2.一型糖尿病中心肌自噬的抑制是不利的

CR-Atg5KO誘導(dǎo)心肌自噬抑制。心肌自噬流在3個月時是完整的，但是在糖尿病發(fā)病6個月時顯著抑制，暗示在一型糖尿病中，高脂血癥在抑制心肌自噬中的分擔(dān)作用。接下來，在表達(dá)mCherry-Gfp-Lc3受體的H9C2心肌細(xì)胞樣細(xì)胞中檢測自噬流和自吞噬泡流出。因自噬溶酶體被紅色熒光標(biāo)記，自噬體被黃色熒光標(biāo)記（紅色和綠色）。H9C2細(xì)胞中基礎(chǔ)自噬以自噬溶酶體居多和少量自噬體為主(Fig.3B)。表明大多數(shù)合成的自噬體不斷與溶酶體融合形成自噬溶酶體，并進(jìn)行降解。因此，溶酶體抑制劑BafA1用于控制自噬，來區(qū)分自噬體與溶酶體融合的數(shù)量。在H9C2細(xì)胞中，棕櫚酸鹽負(fù)擔(dān)抑制了自噬特征通過損害自噬溶酶體流，并且在高糖環(huán)境中，脂質(zhì)過量誘導(dǎo)的自噬抑制加重(Fig. 3B)。然而，CRAtg5KO導(dǎo)致心肌紊亂的早期發(fā)生，并隨著時間的推移促進(jìn)了它的發(fā)展(Fig.4A, 4C)。CRAtg5KO同樣加速了糖尿病誘導(dǎo)的心肌病例改變，包括心肌纖維化，心肌肥大，細(xì)胞死亡和氧化應(yīng)激(Fig. 4B-C)。另外，Atg5的敲除增強了H9C2細(xì)胞死亡，但是在脂質(zhì)積累伴有高糖環(huán)境中沒有改變，暗示抑制自噬是心肌細(xì)胞脂肪毒性和/或葡萄糖毒性的參與機制。結(jié)果表明隨著時間進(jìn)展，糖尿病通過抑制心肌自噬，誘導(dǎo)葡萄糖依賴的心肌細(xì)胞死亡，從而導(dǎo)致糖尿病心肌病的發(fā)病機制

Fig.3

Fig.4

3. 心臟自噬抑制是Nrf2介導(dǎo)的心肌損傷的關(guān)鍵因素

之后，我們研究了心肌自噬抑制對驅(qū)動Nrf2介導(dǎo)的心肌損傷的作用，并且是否能促進(jìn)心肌癥相關(guān)一型糖尿病的進(jìn)程。選擇糖尿病發(fā)病9個月的實驗組，CR-Atg5KO增強了糖尿病誘導(dǎo)的心臟病理重塑和功能障礙(Fig. 5)。這些不良的表型被Nrf2KO所緩解。因為CR-Atg5KO本身不會影響糖尿病的狀態(tài)。這些結(jié)果暗示自噬抑制-Nrf2激活-糖尿病中的心肌損傷和功能紊亂。

Fig.5

4. 在心肌癥中，慢性一型糖尿病通過激活Nrf2誘導(dǎo)鐵死亡

研究顯示Nrf2在阿霉素誘導(dǎo)的鐵死亡中可能有調(diào)節(jié)作用。在心肌細(xì)胞中，脂質(zhì)過氧化物致死積累而產(chǎn)生的鐵依賴形式的細(xì)胞死亡，通過上調(diào)心肌細(xì)胞中HO-1的表達(dá)。在糖尿病發(fā)生9月份，心肌鐵沉積增加；CR-Atg5KO糖尿病誘導(dǎo)的鐵沉積增強；然而NRF2敲除緩解了這兩種增加(Fig. 6A-B)。Fig. 2E,5C顯示鐵死亡脂質(zhì)過氧化的生物標(biāo)記物與4HENE在糖尿病中的改變顯示出相似的模式。這是Nrf2通過增強一型糖尿病鐵沉積和脂質(zhì)過氧化，促進(jìn)心肌細(xì)胞鐵死亡。敲除Nrf2選擇性抑制高脂毒性在鐵死亡抑制劑，Fer-1，鐵螯合劑去鐵胺(DFO)抑制糖脂毒性在H9C2細(xì)胞中(Fig. 6C-E)，提示一型糖尿病晚期發(fā)生的糖醛酸中毒驅(qū)動了nrf2介導(dǎo)的心肌細(xì)胞鐵死亡。結(jié)果提示心肌細(xì)胞中存在慢性一型糖尿病-自噬抑制- nrf2激活-鐵死亡的信號通路。

然后，我們發(fā)現(xiàn)在H9C2細(xì)胞中Nrf2敲除對鐵死亡的作用。在保持自噬完整性的正常葡萄糖水平培養(yǎng)條件下，敲除Nrf2增加細(xì)胞死亡(圖7A-B)。表明Nrf2對自噬功能正常的心肌細(xì)胞具有細(xì)胞保護(hù)作用。同樣，敲除Nrf2(使Nrf2失活)抑制基礎(chǔ)的和erastin誘導(dǎo)的Acsl4的表達(dá)，但是逆轉(zhuǎn)了erastin誘導(dǎo)的Fsp1表達(dá)的抑制當(dāng)上調(diào)基礎(chǔ)表達(dá)(Fig. 7C)。這些結(jié)果顯示Nrf2在抑制心肌細(xì)胞Fsp1的同時促進(jìn)Acsl4的表達(dá)，在GPX4失活的情況下這種作用可能會加劇導(dǎo)致鐵死亡。

一型糖尿病誘導(dǎo)的自噬抑制可能激活nrf2介導(dǎo)的心肌細(xì)胞鐵死亡，從而促進(jìn)糖尿病心肌病的進(jìn)展。

Fig.6

Fig.7