NRF2-LOC344887信號(hào)軸抑制肺纖維化

特發(fā)性肺纖維化(IPF)是一種進(jìn)行性和不可逆的疾病。NRF2的藥理學(xué)激活已被證明是一種有價(jià)值的抗纖維化方法，然而NRF2如何介導(dǎo)抗纖維化功能的詳細(xì)機(jī)制仍不清楚。今天小編為大家?guī)戆l(fā)表于影響因子為9.986的雜志“Redox Biology”的文章“The NRF2-LOC344887 signaling axis suppresses pulmonary fibrosis”，帶大家了解NRF2如何抗肺纖維化。我們的發(fā)現(xiàn)表明NRF2介導(dǎo)的LOC344887上調(diào)通過抑制CDH2和其他纖維化基因的表達(dá)有助于SFN的抗纖維化潛力，為NRF2如何控制特發(fā)性肺纖維化的調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)提供了新的見解。

技術(shù)路線：

結(jié)果：

1）LOC344887是NRF2靶基因

為了確定肺細(xì)胞中可能受NRF2調(diào)節(jié)的lncRNAs，進(jìn)行了人轉(zhuǎn)錄組陣列分析。有趣的是，陣列分析表明，與野生型相比，NRF2敲除細(xì)胞中l(wèi)ncRNA (LOC344887)的表達(dá)顯著降低。野生型和突變型AREs的41-bp序列都被克隆到pGL4.22-熒光素酶載體中(圖1A)。免疫印跡分析表明SFN誘導(dǎo)了NRF2(圖1B)，并且在含有ARE1/2-WT的報(bào)告質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中，相對(duì)熒光素酶活性只在SFN的作用下增加(圖1C)。此外，NRF2-sMAF與ARE1和ARE2相結(jié)合結(jié)合 (圖1D和E)。通過CHIP-qPCR進(jìn)一步證實(shí)NRF2與LOC344887的ARE1和ARE2的內(nèi)源性結(jié)合(圖1F)。此外，與NRF 2+/+細(xì)胞相比，LOC344887的轉(zhuǎn)錄水平在NRF 2/-細(xì)胞中低得多(圖1G)，并且在H1299和HFL1野生型細(xì)胞系中均被SFN顯著增強(qiáng)(圖1H)。重要的是，在NRF2缺失后或SFN處理后，LOC344887的表達(dá)模式與NQO1相似(圖1G和H)?？偟膩碚f，這些結(jié)果表明LOC344887為肺細(xì)胞中的NRF2靶基因。

2）LOC344887敲除增強(qiáng)纖維化基因的表達(dá)

使用CRISPR/Cas9技術(shù)建立LOC344887敲除(KO) A549細(xì)胞系(圖2A)。兩對(duì)引物，一對(duì)定位于pac基因插入位點(diǎn)的上游(引物1)，另一對(duì)定位于下游(引物2)(圖2A)用于qRT-PCR分析。已證實(shí)插入位點(diǎn)下游的LOC344887轉(zhuǎn)錄在LOC344887-KO細(xì)胞中沒有發(fā)生(圖2B)。進(jìn)行RNA-seq分析來比較LOC344887-WT和LOC344887-KO細(xì)胞中全基因組的基因表達(dá)變化。結(jié)果顯示，與LOC344887-WT細(xì)胞系相比，LOC344887-KO中733個(gè)基因上調(diào)，316個(gè)基因下調(diào)(圖2C)。GO和KEGG分析表明，LOC344887的缺失導(dǎo)致許多參與纖維化過程的基因過表達(dá)，包括ECM重組和產(chǎn)生、ECM-受體相互作用和肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架的失調(diào)(圖2D和E)。KEGG通路圖顯示PI3K-AKT信號(hào)通路可能與增強(qiáng)的纖維化過程有關(guān)(圖2E)。在LOC344887敲除細(xì)胞中顯著增加的轉(zhuǎn)錄物的熱圖顯示了許多參與纖維化過程的基因的增強(qiáng)表達(dá)，例如ACTA2(編碼α平滑肌肌動(dòng)蛋白，α-SMA)、COL1A1(編碼I型膠原的主要成分)和FN1(編碼纖連蛋白)等(圖2F)。

3）SFN的抗纖維化功能在很大程度上取決于LOC344887

為了證實(shí)LOC344887在控制肺纖維化中的作用，LOC344887-siRNA被用于敲除HFL1細(xì)胞中的LOC344887轉(zhuǎn)錄物。與圖2所示的RNA-seq數(shù)據(jù)一致，LOC344887敲除在基因和蛋白質(zhì)水平上增強(qiáng)了ACTA2/ α-SMA、COL1A1和FN1的表達(dá)(圖3A–C)。接下來，評(píng)估LOC344887對(duì)先前報(bào)道的SFN抗肺纖維化治療效果的貢獻(xiàn)。為了在體外模擬纖維化，使用了纖維化活化劑TGF-β。在基礎(chǔ)和TGF-β刺激條件下，SFN誘導(dǎo)NRF2表達(dá)并抑制ACTA2/ α-SMA、COL1A1和FN1的表達(dá)。然而，LOC344887敲除顯著限制了SFN對(duì)基礎(chǔ)和TGF- β刺激條件下這些蛋白表達(dá)減少的影響(圖3D和E)。值得一提的是，雖然SFN對(duì)這些纖維化基因表達(dá)的影響在LOC344887敲除組中比對(duì)照組弱得多，但SFN對(duì)NQO1的誘導(dǎo)不受LOC344887敲除的影響(圖3D和E)。

4）LOC344887基因敲除增加CDH2/N- cadherin的表達(dá)

另一個(gè)通過敲除LOC344887而上調(diào)表達(dá)的基因是CDH2，一種編碼跨膜細(xì)胞粘附蛋白N-鈣粘蛋白(N-Cad)的基因(圖4A)。SiRNA介導(dǎo)的HFL1細(xì)胞中LOC344887的敲除證實(shí)了CDH2的轉(zhuǎn)錄上調(diào)(圖4B)。當(dāng)LOC344887被敲除時(shí)，N- Cad的蛋白質(zhì)水平也得到提高(圖4C和D)。由于據(jù)報(bào)道N-Cad與EMT有關(guān)，會(huì)導(dǎo)致肺纖維化，因此檢測(cè)了N-Cad在纖維化基因表達(dá)中的重要性。CDH2的敲除導(dǎo)致ACTA2/α-SMA、COL1A1和FN1的表達(dá)降低(圖4E和F)。更重要的是，LOC344887對(duì)這些基因表達(dá)的影響可以通過敲除CDH2來消除(圖4G和H)。綜上所述，LOC344887可能通過改變CDH2基因表達(dá)來調(diào)節(jié)ACTA2/α-SMA、COL1A1和FN1的表達(dá)。

5）LOC344887通過PI3K- AKT信號(hào)通路調(diào)節(jié)CDH2/N-cad的表達(dá)

KEGG分析表明，受LOC344887敲除影響最大的途徑是PI3K-AKT信號(hào)途徑(圖2E)。事實(shí)上，在A549細(xì)胞中(圖5A和B)和在HFL1細(xì)胞中敲除LOC344887 (圖5C和D)增加了磷酸-AKT (Ser473)的水平，而不改變AKT的總水平。為了進(jìn)一步證實(shí)PI3K-AKT信號(hào)通路在介導(dǎo)LOC344887缺失抗纖維化作用中的必要性，使用了PI3K抑制劑。LY294002不僅降低了磷酸-AKT、N- Cad、FN1、COL1A1和ACTA2/α-SMA的水平，而且完全消除了LOC344887增加這些蛋白的作用(圖5E和F)。因此，PI3K-AKT信號(hào)似乎在介導(dǎo)LOC344887對(duì)CDH2、FN1、COL1A1和ACTA2/α-SMA表達(dá)的影響中起關(guān)鍵作用。

結(jié)論：我們的研究闡明了NRF2-LOC344887在抑制纖維化中的獨(dú)特功能，并為治療人類肺纖維化或其他纖維化疾病開辟了新的治療途徑。

參考文獻(xiàn)：Liu, P., Luo, G., Dodson, M.,et al (2021). The NRF2-LOC344887 signaling axis suppresses pulmonary fibrosis. Redox Biology, 38, 101766. doi:10.1016/j.redox.2020.101766