小膠質(zhì)細(xì)胞HO-1阻斷通過影響鐵死亡在衰老過程中發(fā)揮保護作用

研究背景：HO-1是一種抗炎、抗氧化和具有神經(jīng)保護作用的誘導(dǎo)酶，但是，在衰老過程中和年齡相關(guān)疾病中，HO-1的表達增加與神經(jīng)毒性鐵沉積有關(guān)。因為小膠質(zhì)細(xì)胞與腦內(nèi)固有免疫反應(yīng)有關(guān)，Cristina Fern′ andez-Mendívil等人在Redox Biology（IF= 9.986）這一雜志上發(fā)表文章，闡明在炎癥條件下的老年鼠中小膠質(zhì)細(xì)胞HO-1的作用。

技術(shù)路線圖：

研究結(jié)果：

1. 在LPS 刺激和老年的小鼠腦內(nèi)小膠質(zhì)細(xì)胞中，HO-1的表達上調(diào)

與成年小鼠相比，老年小鼠的大腦中HO-1表達上調(diào)(圖1A-D)。圖1 A和E,與生理鹽水處理的老年鼠相比，LPS處理的老年鼠Iba1⁺小膠質(zhì)細(xì)胞中HO-1水平顯著升高。結(jié)果表明，隨著年齡的增長，小膠質(zhì)細(xì)胞HO-1表達上調(diào)，在急性炎癥損傷中，HO-1的過表達進一步增加。

Fig.1

2. 老年鼠接受炎癥刺激之后，小膠質(zhì)細(xì)胞HO-1的缺失使鐵代謝變化恢復(fù)

如圖2B所示，WT小鼠經(jīng)lps注射之后腦內(nèi)非血紅素鐵的含量顯著增加，但是在HMOX1^M-KO小鼠中并沒有增加。此外，Perl s溶液染色顯示在注射LPS的WT小鼠海馬和皮質(zhì)中鐵積累(圖2C和D),與生理鹽水WT小鼠相比。這些沉積在LPS刺激的HMOX1^M-KO小鼠中較低(圖2C和D)。表明在衰老過程中LPS依賴的小膠質(zhì)細(xì)胞HO-1上調(diào)可能在鐵沉積的形成中發(fā)揮關(guān)鍵作用。LPS處理的WT小鼠大腦中觀察到的鐵沉積與不同鐵代謝標(biāo)志物的改變有關(guān)(圖2E)。鐵轉(zhuǎn)運體DMT1和鐵蛋白L-ferritin升高，而鐵轉(zhuǎn)運蛋白FPN1下降 (圖2E和F)。然而，這些改變在LPS處理的HMOX1M-KO小鼠中被逆轉(zhuǎn)，這意味著在衰老的WT小鼠中，LPS導(dǎo)致了鐵流入和儲存增多，而外排減少，從而導(dǎo)致鐵積累。在老化的HMOX1^M-KO中，沒有鐵積累。

Fig.2

3. 在老年WT小鼠中，炎癥刺激導(dǎo)致腦內(nèi)氧化應(yīng)激，鐵死亡和認(rèn)知降低

    如圖3ABC, 熒光染料H2DCFDA和DHE標(biāo)記小鼠海馬中ROS的產(chǎn)生，發(fā)現(xiàn)在老年WT小鼠中ROS顯著增加，而LPS刺激的HMOX1^M-KO小鼠中，ROS減少。并且，通過圖3A和D 觀察PI染色發(fā)現(xiàn)，LPS注射WT小鼠會導(dǎo)致海馬細(xì)胞死亡的增加。LPS刺激的HMOX1M-KO小鼠中，細(xì)胞死亡減少。LPS注射WT小鼠GPX4的表達降低，HMOX1^M-KO小鼠中沒有變化(圖3E和F)。由于鐵死亡導(dǎo)致神經(jīng)元死亡，之后又研究LPS是否也會導(dǎo)致認(rèn)知能力下降，通過NOR（新事物識別）任務(wù)進行評估 (圖3G)。事實上，LPS在WT小鼠中誘導(dǎo)了認(rèn)知能力的下降，測量結(jié)果是DI的下降，但在HMOX1^M-KO中沒有 (圖3H)。因此，這些結(jié)果表明，在年老的WT小鼠中觀察到LPS誘導(dǎo)的小膠質(zhì)細(xì)胞HO-1的上調(diào)導(dǎo)致的的鐵積累，可能導(dǎo)致OS、鐵下垂，并最終導(dǎo)致認(rèn)知能力下降。但是，LPS處理的HMOX1^M-KO小鼠中，所有這些特征均顯著減弱并部分恢復(fù)。

Fig.3

4. 小膠質(zhì)細(xì)胞HO-1缺失改善了LPS誘導(dǎo)的炎癥狀況和衰老小鼠的疾病行為

報道顯示鐵沉積與神經(jīng)炎癥關(guān)系密切。之后，我們研究了LPS依賴性的小膠質(zhì)細(xì)胞HO-1過表達，除了導(dǎo)致鐵代謝改變外，是否與腦內(nèi)促炎改變相關(guān)，盡管其具有抗炎作用。我們分析了LPS注射24小時后海馬區(qū)不同的炎癥標(biāo)志物(圖4A)。iNOS和p65,與炎癥小體相關(guān)蛋白質(zhì)NLRP3、 caspase-1和IL- 1β,和細(xì)胞因子TNF -α和IL- 1β(圖4 e)。與注射鹽水的WT小鼠相比，注射LPS的WT小鼠中這些蛋白或細(xì)胞因子的表達顯著增加。然而，LPS刺激的HMOX1^M-KO小鼠中這些參數(shù)顯著降低。

Fig.4

5. ZnPP對HO-1的藥理抑制可以恢復(fù)LPS引起的炎癥、氧化和鐵變化

使用ZnPP作為HO-1抑制劑，證實遺傳小鼠模型獲得的結(jié)果。按照圖6A的方法。ZnPP減少了LPS誘導(dǎo)的非血紅素鐵的積累(圖6B)， ZnPP能夠至少部分恢復(fù)LPS誘導(dǎo)的鐵代謝改變(圖6D)。此外，ZnPP處理降低了LPS誘導(dǎo)的iNOS、p65和CD68的增加(圖6E和F)、炎性體相關(guān)蛋白、IL-1β、NLRP3和caspase-1的表達(圖6G和H) 以及細(xì)胞因子TNF和IL-1表達減少(圖6I)。此外，ZnPP改善了小鼠在疾病行為測試中的表現(xiàn)(圖6J和K)。綜上所述，這些結(jié)果支持了HO-1在受到炎癥刺激的老年鼠中對鐵代謝、炎癥和行為改變的作用

Fig.5

6. 去鐵胺（DFX）治療可以改善LPS處理的老年小鼠的鐵代謝改變、炎癥和疾病行為

DFX能夠減少不穩(wěn)定鐵(圖7B)并恢復(fù)LPS誘導(dǎo)的鐵代謝變化(圖7 c和D). 此外,DFX減少炎性標(biāo)記物的表達,如iNOS和p65, 而不是CD68(圖7E和F)和炎性體相關(guān)標(biāo)志物NLRP3、caspase-1和成熟IL-1 (圖7 g和H)。此外,DFX也減少了TNF-α和IL- 1β (圖7I)。此外，DFX改善了小鼠在疾病行為任務(wù)中的表現(xiàn)(圖7J和K)。DFX能夠恢復(fù)LPS處理的老年小鼠的大部分變化，這一事實表明，老年WT小鼠中，鐵負(fù)荷可能是LPS依賴性小膠質(zhì)細(xì)胞HO-1過表達的結(jié)果，與炎癥、氧化應(yīng)激和認(rèn)知障礙有關(guān)。

Fig.6