帕金森病的幕后黑手circSLC8A1與氧化應(yīng)激

環(huán)狀RNA（circRNA）大量存在于大腦中，但絕大部分功能未知。為了尋找它們?cè)谂两鹕膊。?/span>PD）中的功能，作者對(duì)PD捐贈(zèng)患者和對(duì)照供體大腦的不同腦區(qū)域組織進(jìn)行RNA測(cè)序，篩選出與PD相關(guān)的circRNA和腦組織。本文于2020年9月發(fā)表在《EMBO Molecular Medicine》IF：8.821期刊上。

本文技術(shù)路線如下：

主要結(jié)果如下：

1、研究PD大腦circRNA的基因組資源

為了確定大范圍的基因表達(dá)和circRNA表達(dá)譜，特別是circRNA在PD個(gè)體特定腦區(qū)中是如何發(fā)生改變的，作者對(duì)PD患者和健康人的杏仁核（AMG），黑質(zhì)（SN）和內(nèi)側(cè)顳肌腦回（MTG）進(jìn)行了測(cè)序。最初的非監(jiān)督層次聚類的樣品異質(zhì)性分析顯示MTG和ATG樣品的大量集群不能區(qū)分PD和對(duì)照患者（Figs 1A and B）。這可能反映了個(gè)體間的異質(zhì)性。但SN腦區(qū)的基因表達(dá)可以區(qū)分PD和對(duì)照，這可能反映了由于SN中多巴胺能神經(jīng)元缺失而導(dǎo)致的基因表達(dá)的更大差異（Figs 1C）。相一致的，酪氨酸羥化酶（TH）的水平在PD SN樣本中顯著下降，與PD時(shí)該腦區(qū)多巴胺能代謝的主要減少相匹配（Fig 1D）。

隨后作者對(duì)差異表達(dá)基因（DEG）進(jìn)行了GO分析，結(jié)果顯示主要富集與細(xì)胞粘連，多巴胺生物合成過程等（Fig 1E）。隨后作者使用單細(xì)胞RNA測(cè)序數(shù)據(jù)確定表達(dá)這些DEG的細(xì)胞類型，發(fā)現(xiàn)這些DEG轉(zhuǎn)錄本主要表達(dá)在內(nèi)皮細(xì)胞、少突膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞比神經(jīng)元和小膠質(zhì)細(xì)胞表達(dá)更高的比例（Fig 1F and G）。此外，SN神經(jīng)元特異性DEG在PD中顯著減少，少突膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞表達(dá)基因有增加的趨勢(shì)，可能反映了炎癥的升高。

為了尋找特異性DEG的共表達(dá)基因，進(jìn)行了WGCNA分析，結(jié)果顯示基因被分成15個(gè)不同的模塊，并評(píng)估了模塊與性別，年齡，腦區(qū)等特征的關(guān)系。還鑒定了幾個(gè)模塊與特征的相關(guān)性，如Fig 1I所示，藍(lán)色模塊與腦區(qū)具有相關(guān)性，青色模塊與性別相關(guān)。通路分析和對(duì)組織相關(guān)模塊豐富GO項(xiàng)的搜索進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)了各種神經(jīng)元和突觸功能項(xiàng)，并將疾病相關(guān)模塊與轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)、RNA加工和線粒體聯(lián)系起來（Fig 1J）。這些結(jié)果可以確定PD大腦中circRNA水平的潛在變化。

Figure 1腦區(qū)域特異性mRNA表達(dá)譜顯示多細(xì)胞PD相關(guān)過程

2、SN表現(xiàn)出獨(dú)特的受PD影響的circRNA表達(dá)譜

外顯子環(huán)化反映了線性和反向剪接過程的選擇（Fig 2A）。為了鑒定PD中發(fā)生改變的circRNA，使用兩種不同的方式進(jìn)行circRNA鑒定和定量。結(jié)果發(fā)現(xiàn)3407個(gè)只在PD大腦中表達(dá)的circRNA，1028個(gè)只表達(dá)于健康人的（Fig 2B）。重要的是，2755個(gè)circRNA存在于所有的腦區(qū)，但2914，3918，2483個(gè)circRNA分別只存在于AMG，SN，MTG中（Fig 2C）。無監(jiān)督分層PCA聚類將SN circRNA和AMG，MTG的區(qū)分開來，和之前的DEG類似（Fig 2D）。此外，分別有26%的circRNA和mRNA特異性只存在于SN中，而只有19%的circRNA存在于所有組織，但有82%mRNA同時(shí)存在于所有組織（Fig 2E and F）。隨后，作者對(duì)表達(dá)這些差異circRNA的細(xì)胞進(jìn)行分類，發(fā)現(xiàn)這些circRNA主要由神經(jīng)元，少突細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞表達(dá)（Fig 2G），表明在這些組織中circRNA多由這幾類細(xì)胞表達(dá)。

Figure 2 CircRNA豐度具有腦區(qū)依賴性和PD修飾性

在健康供體中，SN表達(dá)circRNA的總數(shù)目顯著高于MTG和AMG，這暗示著SN細(xì)胞擁有circRNA生物發(fā)生的特定調(diào)控模式（Fig 3A）；當(dāng)與健康供體相比，可以發(fā)現(xiàn)circRNA的數(shù)目在PD患者的MTG和AMG顯著升高，而PD患者的SN中顯著減少（Fig 3A）。這些可能與PD患者的SN中的神經(jīng)元細(xì)胞丟失相關(guān)并可能是繼發(fā)性的，以及/或該腦區(qū)域的剪接事件的改變。隨后計(jì)算了Alu編輯指數(shù)，它代表了所有RNA樣本中所有表達(dá)Alu序列的加權(quán)平均編輯水平。結(jié)果顯示，與其他大腦區(qū)域相比，SN的整體編輯水平較低（Fig 3B）。這些差異是RNA編輯活性的結(jié)果。還觀察到在個(gè)體樣本中，RNA編輯水平和circRNA的數(shù)量呈負(fù)相關(guān)（Figs 3D）。雖然從對(duì)照到PD樣本ADAR1水平?jīng)]有變化，但對(duì)不同組織分別進(jìn)行探查發(fā)現(xiàn)，SN中ADAR1水平較其他組織低(Fig 3E)。因而認(rèn)為RNA編輯和RNA環(huán)化在PD和對(duì)照組的腦的幾個(gè)區(qū)域中是負(fù)相關(guān)的。

接下來驗(yàn)證circRNA積累與年齡的關(guān)系，結(jié)果在健康SN中發(fā)現(xiàn)circRNA積累與年齡正相關(guān)，但在PD患者的SN中 circRNA積累與年齡負(fù)相關(guān)（Fig 3F and 3G）。這些差異可能是由于circRNA在SN中的整體合成或降解速率的差異。但是circRNA積累和年齡的相關(guān)性在病變組織中并為觀察到，提示這種SN中circRNA積累和年齡的特異性相關(guān)反應(yīng)了PD中多巴胺能神經(jīng)元的大量丟失，盡管不能排除次生效應(yīng)。差異表達(dá)分析鑒定到了24個(gè)差異表達(dá)的circRNA，并表明circSLC8A1在PD中顯著上調(diào)從而引起了作者的興趣（Fig 3H）。這些結(jié)果表明，相對(duì)于其他被測(cè)的大腦區(qū)域，circRNA在SN中受到獨(dú)特而強(qiáng)烈的調(diào)控，并提示了circRNA在PD中可能受到損害的潛在年齡相關(guān)作用。

Figure 3 circRNA豐度在PD SN中降低，與RNA編輯水平呈負(fù)相關(guān)

3、CircSLC8A1在PD腦中上調(diào)

CircSLC8A1，在PD SN中顯著上調(diào)，起源于神經(jīng)表達(dá)的SLC8A1基因，它編碼一個(gè)Ca2+/Na+轉(zhuǎn)運(yùn)體，有助于平衡細(xì)胞質(zhì)Ca2+水平和監(jiān)控Ca2+依賴的神經(jīng)傳遞（Fig 4A and B）。不同于circSLC8A1在PD SN中顯著上調(diào)，線性的SLC8A1 mRNA在CT和PD之間沒有明顯差異（Fig 4C and 4D）。circSLC8A1的表達(dá)與性別無關(guān)，但在健康的SN中與線性mRNA的表達(dá)呈正相關(guān)，而在PD中這種相關(guān)性丟失了（Fig 4E-G）。這些表明疾病誘導(dǎo)的circSLC8A1下降的調(diào)控超過了circSLC8A1生產(chǎn)和/或破壞。

4、氧化應(yīng)激使神經(jīng)元的circSL8A1升高，并減少SLC8A1蛋白質(zhì)

百草枯（PQ）已知會(huì)增加PD的風(fēng)險(xiǎn)，作者將神經(jīng)細(xì)胞暴露于PQ中，結(jié)果發(fā)現(xiàn)PQ暴露選擇性誘導(dǎo)了circSL8A1的劑量依賴性升高，但對(duì)其余的circRNA的表達(dá)沒有顯著影響，暗示氧化本身可能會(huì)增加神經(jīng)元中circSLC8A1的環(huán)化或減少circRNA的降解（Fig 4H）。還觀察到SLC8A1的蛋白水平呈劑量依賴性下降，盡管SLC8A1 mRNA水平不變（Fig 4I and J）。這可能反映了在24小時(shí)內(nèi)該蛋白降解速率加快和/或轉(zhuǎn)譯速率降低。

Figure 4 PD腦中的CircSLC8A1升高，PQ暴露時(shí)伴有SLC8A1蛋白的抑制

考慮到PQ對(duì)circSLC8A1水平的強(qiáng)烈影響，作者想知道兩種已知的PD保護(hù)劑，降膽固醇藥辛伐他汀和已知的LRRK2抑制劑PF-06447475是否會(huì)以相反的方式改變circSLC8A1。事實(shí)上，兩種神經(jīng)保護(hù)劑均能顯著降低circSLC8A1的表達(dá)，也觀察到線性SLC8A1 mRNA水平下降（Fig 5A），這導(dǎo)致他汀類藥物治療的SH-SY細(xì)胞中SLC8A1蛋白水平下降（Fig 5B and C）。免疫染色顯示，在他汀類藥物作用下，SLC8A1免疫標(biāo)記蛋白的細(xì)胞質(zhì)表達(dá)較低。結(jié)論是，在神經(jīng)保護(hù)細(xì)胞中，SLC8A1和circSLC8A1水平都下降。

Figure 5在神經(jīng)保護(hù)下，CircSLC8A1降低

5、CircSLC8A1與Ago2結(jié)合，可能調(diào)節(jié)miR-128的靶點(diǎn)

形成人的circSLC8A1轉(zhuǎn)錄本的外顯子是開放閱讀框的一部分。因此，這個(gè)外顯子在進(jìn)化上保守：在人類、小鼠和大鼠的基因組中，這個(gè)外顯子分別有88%和87%的序列保守（Fig 6A）。通過qRTPCR對(duì)細(xì)胞進(jìn)行亞分類，發(fā)現(xiàn)circSL8A1像大多數(shù)circRNAs一樣定位于細(xì)胞質(zhì)（Fig 6B）。進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)人circSLC8A1在神經(jīng)細(xì)胞中與Ago2相互作用(圖6C)，并具有特異性的連接位點(diǎn)（Fig 6D）。于是，作者預(yù)測(cè)了與circSLC8A1相互作用的miRNA，如Fig 6E。其中在circSLC8A1上發(fā)現(xiàn)了7個(gè)miR-128的潛在靶點(diǎn)，其中三個(gè)位點(diǎn)被鑒定為ago2結(jié)合位點(diǎn)（Fig 6E）。因此預(yù)估了circSLC8A1與miR-128的相互作用。如果兩者有調(diào)控關(guān)系，則miR-128的靶基因會(huì)隨著circSLC8A1的表達(dá)上調(diào)（Fig 6F）。結(jié)果表明，miR-128的所有靶基因都在PD的SN中顯著上調(diào)，而PQ處理的神經(jīng)細(xì)胞系中，miR-128的靶基因上調(diào)趨勢(shì)和circSLC8A1的表達(dá)一致（Fig 6G and H）。表明circSLC8A可能調(diào)控miR-128靶點(diǎn)。

Figure 6在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)circSLC8A1與Ago2結(jié)合并調(diào)控miR-128靶點(diǎn)

本文的發(fā)現(xiàn)建立了PD患者大腦中circRNA表達(dá)譜，揭示了之前未知的circRNA表達(dá)、氧化應(yīng)激和PD病理之間的聯(lián)系，并呼吁探索circSLC8A1積累對(duì)PD神經(jīng)退行性過程啟動(dòng)的影響。

參考文獻(xiàn)：

Hanan Mor., Simchovitz Alon., Yayon Nadav., Vaknine Shani., Cohen-Fultheim Roni., Karmon Miriam., Madrer Nimrod., Rohrlich Talia Miriam., Maman Moria., Bennett Estelle R., Greenberg David S., Meshorer Eran., Levanon Erez Y., Soreq Hermona., Kadener Sebastian.(2020). A Parkinson's disease CircRNAs Resource reveals a link between circSLC8A1 and oxidative stress. EMBO Mol Med, 12(9), e11942. doi:10.15252/emmm.201911942