微生物組和轉(zhuǎn)錄組聯(lián)合揭示肝細(xì)胞癌發(fā)病機(jī)制和臨床預(yù)后

據(jù)統(tǒng)計(jì)，包括肝細(xì)胞癌（HCC）在內(nèi)的原發(fā)性肝癌（占病例的80％）是全球癌癥相關(guān)死亡的第四大主要原因。肝臟與腸道關(guān)系密切，并執(zhí)行與營(yíng)養(yǎng)代謝、免疫力和細(xì)菌代謝產(chǎn)物的生物轉(zhuǎn)化有關(guān)的必要功能，這種交流稱為腸道-肝軸。完整的腸肝軸取決于完整的腸屏障、健康的腸道菌群和正常的肝功能。腸道菌群是與人體共生的最重要的微生態(tài)系統(tǒng)。此外，還發(fā)現(xiàn)了一些臨床特征（年齡、體重指數(shù)、飲食習(xí)慣和體育鍛煉）對(duì)健康中國(guó)人的腸道微生物組有不同的影響。肝疾病，如非酒精性脂肪肝病和肝硬化，通常與具有改變的腸道微生物群相關(guān)聯(lián)，并且腸道細(xì)菌產(chǎn)物有助于肝癌發(fā)生。先前的研究已經(jīng)表明，腸道微生物是西北、中部和華東地區(qū)早期和晚期HCC的非侵入性生物標(biāo)志物。然而，尚無(wú)關(guān)于大批HCC患者的腸道微生物特征是否可用于評(píng)估臨床預(yù)后的報(bào)道，以及腸道菌群如何影響HCC轉(zhuǎn)錄組譜尚不清楚。近期，浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院肝膽胰外科鄭樹(shù)森教授及其團(tuán)隊(duì)獲得了華東地區(qū)患者肝轉(zhuǎn)錄組和腸道微生物組的配對(duì)數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)在具有高腫瘤負(fù)擔(dān)的HCC患者中，擬桿菌、毛螺旋菌和梭菌XIVa富集，且這三個(gè)屬中與腫瘤免疫微環(huán)境或膽汁酸代謝相關(guān)的六個(gè)重要微生物標(biāo)志物具有預(yù)測(cè)臨床結(jié)果的潛力，相關(guān)研究以“Integrated analysis of microbiome and host transcriptome reveals correlations between gut microbiota and clinical outcomes in HBV-related hepatocellular carcinoma”為題發(fā)表在Genome Med上，雜志影響因子10.675。

技術(shù)路線：

結(jié)果：

1.      臨床特征和微生物多樣性

113例HBV相關(guān)的HCC患者和100名健康志愿者，都是華東地區(qū)的漢族人群，他們具有類似的飲食習(xí)慣（混合飲食），以排除飲食差異。這些組的臨床病理特征通常匹配，包括年齡、性別、BMI、腫瘤分化和Child-Pugh評(píng)分，表明在收集樣本之前，尚無(wú)確定的混雜因素影響群體歧視（圖A）。肝癌患者的血清甲胎蛋白（AFP）水平明顯高于健康對(duì)照者，但AFP水平無(wú)法區(qū)分HCC患者的腫瘤大小或肝硬化。進(jìn)行分類分配后，總共獲得了7934068個(gè)合格序列和1296個(gè)OUT。稀疏分析發(fā)現(xiàn)，健康對(duì)照組和HCC組OTU的估計(jì)豐富度幾乎達(dá)到飽和（圖B）。與對(duì)應(yīng)物相比，在非小型HCC中，每個(gè)樣品中糞便微生物物種的多樣性顯著增加（圖C-E）。然而，健康志愿者和HCC患者之間無(wú)差異。維恩圖顯示，三組共有1002個(gè)OTU的總豐富度為541個(gè)（所有參與者中294個(gè)OTU的豐度均為零），而小HCC和非小HCC亞組共有877個(gè)OTU中的576個(gè)（圖F）。值得注意的是，1002個(gè)OTU中有75個(gè)是非小HCC組所特有的。對(duì)于β多樣性，通過(guò)Bray-Curtis距離評(píng)價(jià)的NMDS圖揭示了腸道菌群在所有成對(duì)樣本中的對(duì)稱分布（圖G）。

2.      微生物群落表達(dá)譜

三個(gè)主要細(xì)菌門是擬桿菌門、厚壁菌門和變形菌門，總共占OTU的90%（圖A，B）。圖C和圖D顯示了屬水平上細(xì)菌群落（前10位）的平均組成。與健康對(duì)照組相比，HCC組中的擬桿菌、毛螺旋菌和梭菌XIVa富集（圖E）。當(dāng)進(jìn)一步分析HCC組中分層的其他臨床特征時(shí)，擬桿菌、毛螺旋菌、梭菌XIV和副擬桿菌在非小HCC亞組中與小HCC亞組相比顯著富集（圖F，G）；為了發(fā)現(xiàn)高維生物標(biāo)志物，應(yīng)用LEfSe鑒定與不同臨床特征相關(guān)的主要細(xì)菌分類群。擬桿菌、毛螺旋菌和梭菌XIVa在非小HCC亞組患者糞便中顯著過(guò)度表達(dá)，進(jìn)一步對(duì)這3個(gè)屬的相對(duì)豐度進(jìn)行聚類分析，結(jié)果表明這3個(gè)屬在非小HCC亞組中含量豐富（圖H）。?；?/span>圖顯示了健康對(duì)照組和小HCC和非小HCC患者中分類群（門和屬）的主要比例。在高腫瘤負(fù)荷的參與者中，這三個(gè)菌屬的比例逐漸增加并成為主要菌屬，伴隨著其他細(xì)菌的變化（圖I）。

3.      肝臟腫瘤轉(zhuǎn)錄組概況

由于HCC患者證明了微生物群與臨床特征（腫瘤負(fù)荷）的顯著相關(guān)性，作者假設(shè)肝臟腫瘤發(fā)生轉(zhuǎn)錄組的變化可能與腸道菌群相關(guān)。113例患者中，根據(jù)測(cè)序的嚴(yán)格標(biāo)準(zhǔn)，最終收集32例HCC患者的配對(duì)腫瘤和癌旁非腫瘤肝組織。在這32例患者中，23例患有非小HCC。通過(guò)edgeR在32對(duì)腫瘤和癌旁非腫瘤肝組織中共鑒定出8101個(gè)差異表達(dá)基因（圖A）?；诔醪降幕蜃⑨尯屯贩治?，29個(gè)差異表達(dá)基因被鑒定為與6個(gè)OTU（擬桿菌、毛螺旋菌和梭菌XIVa的成員）呈負(fù)相關(guān)，形成31個(gè)OTU基因?qū)?。圖C和D顯示了兩個(gè)典型的OTU基因?qū)Γ?/span>OTU_0134-CD6和OTU_0002-MAPK10）。在32例患者中，OTU_0134豐度的增加伴隨著HCC組織中CD6表達(dá)的降低，很明顯這種類型的下調(diào)在非小HCC患者中尤為明顯。小HCC通常意味著更好的臨床結(jié)果，基于GEPIA的Cox風(fēng)險(xiǎn)模型表明CD6和MAPK10是與良好臨床預(yù)后相關(guān)的腫瘤抑制因子。兩組之間蛋白水平的不同表達(dá)水平也顯示出與轉(zhuǎn)錄組學(xué)相同的結(jié)果（圖E，F）

作者對(duì)非小肝癌亞組與小肝癌亞組中差異表達(dá)的29個(gè)基因進(jìn)行功能注釋，通路分析顯示，這29個(gè)基因聚集在免疫相關(guān)通路上（T細(xì)胞受體信號(hào)傳導(dǎo)、T細(xì)胞增殖的正調(diào)控、自然殺傷細(xì)胞活化和NOD樣受體信號(hào)傳導(dǎo)、對(duì)細(xì)菌來(lái)源分子的反應(yīng)等），這些通路是腫瘤免疫微環(huán)境的組成部分（圖B，C）。為了闡明這些基因在腫瘤免疫微環(huán)境中的定位和作用，作者在HCC的獨(dú)立單細(xì)胞圖譜數(shù)據(jù)庫(kù)中發(fā)現(xiàn)22個(gè)基因在CD4+ T細(xì)胞中高表達(dá)，23個(gè)基因在CD8+ T細(xì)胞中高表達(dá)，23個(gè)基因在NK細(xì)胞中高表達(dá)，18個(gè)基因在巨噬細(xì)胞中高表達(dá)，17個(gè)基因在B細(xì)胞中高表達(dá)。根據(jù)GEPIA，這些基因也具有相互依賴的關(guān)系，表明腸道菌群可能通過(guò)一個(gè)共同因素影響HCC的轉(zhuǎn)錄組（圖D）。

4.      HCC腸道菌群和轉(zhuǎn)錄組之間的重要通訊介質(zhì)

對(duì)于個(gè)體內(nèi)相關(guān)性分析，作者重點(diǎn)關(guān)注臨床特征（如BMI、AST和甘油三酯的所有值或異常值）和腸道菌群（75個(gè)OTU與擬桿菌、毛螺旋菌和梭菌XIVa匹配）之間的相關(guān)性?；?/span>Pearson相關(guān)性的分析顯示4個(gè)膽汁酸相關(guān)OTU，而其他臨床特征未發(fā)現(xiàn)陽(yáng)性和有意義的結(jié)果（圖A），且在32對(duì)肝組織樣本中鑒定出與這4種OTU相關(guān)的25個(gè)基因，這些基因影響肝臟膽汁酸代謝（細(xì)胞外和細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)、轉(zhuǎn)錄因子以及膽汁酸合成和外排）（B）。免疫組織化學(xué)證實(shí)，ATP結(jié)合盒亞家族C成員4（ABCC4）蛋白在高水平膽汁酸患者的腫瘤和癌旁非腫瘤肝組織中均高表達(dá)，提示膽汁酸可能是HCC腸道菌群與宿主轉(zhuǎn)錄組交流的重要介質(zhì)（圖C）。

5.      臨床預(yù)后微生物標(biāo)志物的鑒定

在113例患者中，高腫瘤負(fù)荷（非小HCC）和較高的膽汁酸水平表明臨床結(jié)局較差（圖A，B），通過(guò)評(píng)估以下OTU來(lái)評(píng)估腸道菌群預(yù)測(cè)臨床預(yù)后的能力：OTU_0002、OTU_0033和OTU_0134（與腫瘤免疫微環(huán)境和膽汁酸代謝均相關(guān)）、OTU_0794（與腫瘤免疫微環(huán)境相關(guān)）和OTU_0030（與膽汁酸代謝相關(guān)），并構(gòu)建了隨機(jī)森林和支持向量機(jī)分類器模型，以預(yù)測(cè)113例患者的臨床預(yù)后（圖C）。這些OTU對(duì)于區(qū)分5年生存率具有良好的分類性能，數(shù)據(jù)表明這些與HCC腫瘤免疫微環(huán)境和膽汁酸代謝有關(guān)的OTU標(biāo)志物有可能預(yù)測(cè)臨床預(yù)后。

結(jié)論：

1、擬桿菌、毛螺旋菌和梭菌XIVa在高腫瘤負(fù)荷的HCC患者中富集，血清膽汁酸可能是這3個(gè)屬與宿主轉(zhuǎn)錄組之間的重要通訊介質(zhì)；在這3個(gè)屬中，與腫瘤免疫微環(huán)境或膽汁酸代謝相關(guān)的6個(gè)重要微生物標(biāo)志物顯示出預(yù)測(cè)臨床結(jié)局的潛力。

2、總之，腸道菌群通過(guò)血清膽汁酸引起的腫瘤免疫微環(huán)境變化可能是與腫瘤負(fù)荷和不良臨床結(jié)局相關(guān)的重要因素。腸道微生物可以作為臨床特征和結(jié)果的生物標(biāo)志物，宿主腫瘤的微生物相關(guān)轉(zhuǎn)錄本可以部分解釋腸道菌群如何促進(jìn)HCC發(fā)病。

參考文獻(xiàn)：

Huang HC, Ren ZG, Gao XX, et al. Integrated analysis of microbiome and host transcriptome reveals correlations between gut microbiota and clinical outcomes in HBV-related hepatocellular carcinoma. Genome Med. 2020.