熱敏感性外泌體-脂質體混合納米顆粒介導的化療免疫治療改善轉移性腹膜癌的治療
轉移性腹膜癌(MPC)是一種未經(jīng)有效治療的致命性疾病。為了改善這種疾病的治療，最近發(fā)展起來的熱療腹腔化療(HIPEC)已經(jīng)成為治療的標準。然而，這種方法的療效受到藥物滲透效率低和快速發(fā)展的耐藥性的限制。有鑒于此，中山大學的Jie Liu、中山大學第三附屬醫(yī)院的Bo Liu和美國耶魯大學的Jiangbing Zhou等研究人員，報告了一種納米技術方法，旨在改善對MPC的藥物輸送，并通過提供化學免疫治療來增強HIPEC的療效。
轉移性腹膜癌(mPC)是一種沒有有效治療的致命疾病。在目前的治療標準下，mPC患者通常會在幾個月內(nèi)死于該病。為了改善這種疾病的治療，一種新的方法被開發(fā)出來，稱為高溫腹腔化療(HIPEC)，它涉及加熱的腹腔內(nèi)藥物填充。不幸的是，越來越多的證據(jù)表明，HIPEC的治療效益受到藥物滲透效率低和快速產(chǎn)生耐藥性的限制。不幸的是，越來越多的證據(jù)表明，HIPEC的治療效益受到藥物滲透效率低和快速產(chǎn)生耐藥性的限制。研究表明，腹腔內(nèi)化療對直徑大于1cm的腹腔腫瘤患者療效不佳。因此，進一步提高mPC的治療水平，需要開發(fā)具有組織相容性的藥物傳遞系統(tǒng)，增強藥物向腫瘤的傳遞，使多模態(tài)聯(lián)合治療克服耐藥成為可能。
本文報道了一種納米技術方法，旨在通過化療免疫治療來改善藥物給藥到MPC和增強HIPEC的療效。首先，確定HIPEC的藥物傳遞效率，發(fā)現(xiàn)化療藥物不能有效地傳遞給大腫瘤結節(jié)。為了克服遞送障礙，隨后合成了基因工程外泌體-熱敏脂質體雜交NPs，或gETL NPs，并證明NPs在靜脈注射后能有效地進入mPC腫瘤，并在HIPEC低溫條件下釋放有效載荷。最后，研究表明，granulocyte-macrophage集落刺激因子(GM-CSF)與多西他賽共送時，gETL NPs能有效抑制腫瘤的發(fā)生，而HIPEC共送時療效增強。本研究提供了一種改善藥物給mPCs的策略，并通過聯(lián)合局部HIPEC和gETL NPs的全身化療免疫治療，提供了一種有前景的方法來改善疾病的治療。
本文要點
1）首先，測定了HIPEC的藥物輸送效率，發(fā)現(xiàn)化療藥物不能有效地輸送到大的腫瘤結節(jié)。
2）為了克服遞送障礙，隨后合成了基因工程外泌體‐熱敏脂質體雜交NPs，或gETL NPs，并證明NPs在靜脈注射后能有效地滲透到mPC腫瘤中，并在HIPEC低溫條件下釋放有效載荷。
3）結果表明，粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)與多西紫杉醇聯(lián)合應用時，gETL NPs可有效抑制腫瘤生長，HIPEC聯(lián)合應用可增強gETL NPs對腫瘤生長的抑制作用。
本研究提供了一種改善mPCs藥物傳遞的策略，并通過聯(lián)合局部HIPEC和gETL NPs的全身化療免疫治療，為改善該病的治療提供了一種有前途的方法。
技術路線：
一、HIPEC在給藥過程中局限性的特征
A. 利用小鼠結直腸癌CT26細胞來源的mPC模型，研究HIPEC給藥的效率。奧沙利鉑(Pt)是HIPEC中常用的一種化療藥物，給予荷瘤小鼠150或75 mg m-2.
B. 30 min后處死小鼠，分離腫瘤并在單細胞水平上進行電感耦合等離子體質譜(ICP-MS)分析。在75 mg m-2劑量下，游離瘤細胞(FC)、小瘤結節(jié)(SN、體積小于10 mm3)和大結節(jié)(LN，體積大于等于10 mm3)。
C. 在兩種劑量下，與大劑量相比，SN具有更大的藥物穿透和吸收能力。
D. 例如，在75 mg m2的劑量下，F(xiàn)C、SN和LN中鉑的平均重量分別為1417.8、313.1和217.8 ag，而在150 mg m2 Pt時，F(xiàn)C、SN和LN細胞的平均重量分別為1664.8、480.4和398.5 ag。
總之，這些結果表明，HIPEC釋放腫瘤細胞的藥物遞送效率足以殺死細胞，mPC腫瘤結節(jié)的給藥效率取決于腫瘤大小和給藥濃度，需要進一步改善藥物遞送到腫瘤結節(jié)的效果，特別是對于那些較大的結節(jié)。
A-B.透射電鏡分析顯示，gETL NPs與脂質體形態(tài)相似，平均直徑為135.7 nm, Zeta電位為?8.2 mV。
C. 透射電鏡證實外泌體或gETL NPs表面存在CD9珠.
D. gETL NPs處理組的熒光強度強于脂質體處理組，提示外泌體成分的包含促進了細胞攝取.
E. G/D-gETL NPs中GM-CSF和DTX的含量分別為7.2 pg μg -1和4.3%，低于轉基因外泌體中GM-CSF的含量(26.65 pg μg -1)。
F. 與基因工程細胞和外泌體類似，56.8%的gETL NPs呈 CD47陽性，而5%的ETL NPs是由野生型外泌體產(chǎn)生的
三、gETL NPs與HIPEC在體外協(xié)同抑制腫瘤細胞增殖
A.在37℃和39℃時，DTX在前60分鐘內(nèi)的釋放分別被限制為11%和34%。
B.相比之下，77%的DTX在42℃的前10 min內(nèi)釋放。
C-D.gETL NPs對于臨床應用具有潛在的安全性。相反，載藥NPs在42℃時的細胞毒性比37℃時更大.
E. G/D-gETL NPs誘導細胞凋亡的速率明顯大于裝載DTX脂質體和游離DTX，且聯(lián)合Pt處理時凋亡速率增加.
G/D-gETL NPs是否使M2表型巨噬細胞重新極化為M1表型。通過IL-4誘導RAW264.7巨噬細胞形成M2表型，然后與G/D-gETL NPs或游離GM-CSF孵育.
24 h后，分別對M1表型表面標記物CD86和M2表型表面標記物CD206進行免疫染色，CLSM分析。與游離GM-CSF相似，G- getl和G/D-gETL NPs有效地將巨噬細胞從M2表型轉化為M1表型.
C-D. G/D-gETL NPs轉換巨噬細胞表型的效率可與游離GM-CSF相比，并且轉換活動是獨立于封裝的DTX.
A-B. 孵育6h后，CLSM和流式細胞儀檢測腫瘤細胞的吞噬能力。
C. 經(jīng)gETL NP處理的巨噬細胞吞噬效率為32.5%，與CD47蛋白處理的巨噬細胞(37.2%)相當，約為PBS(5.4%)和ETL NPs(6.9%)巨噬細胞吞噬效率的6倍。
D. CLSM分析發(fā)現(xiàn)，與PBS或ETL NPs處理巨噬細胞表面熒光較強不同，gETL NPs或CD47蛋白處理巨噬細胞表面熒光可忽略不計.
E. FITC熒光半定量分析發(fā)現(xiàn)，經(jīng)gETL NPs處理和CD47蛋白處理的巨噬細胞的相對平均熒光強度(MFI)分別為20.6%和17.4%;相比之下，PBS或ETL NPs處理巨噬細胞的值為97.8.
總之，gETL NPs通過與巨噬細胞表面SIRP的競爭性相互作用促進巨噬細胞的吞噬。
A. 肝臟中脂質體的積累明顯多于腫瘤，48 h后大部分脂質體被清除.
B. 基于熒光強度的半定量分析顯示，在注射48 h后，腫瘤組織中gETL NPs的積累量分別是脂質體組和ETL np組小鼠的3.3倍和2.1倍.
C. 48 h時，肝內(nèi)gETL NPs的高積累可能與其血液循環(huán)時間長有關。然后我們進一步測定了包裹DTX合成的NPs的血液循環(huán)。使用游離DTX、DTX加載脂質體或DTX加載ETL NPs處理的小鼠作為對照組。與對照組相比，gETL NPs顯著延長了血液循環(huán)時間。
D. 間隙一半時間(t1/2β)ETL NPs和gETL NPs分別為0.5、3.5、6.2和8.1 h.
E. 與Lips組相比，ETL NPs組體內(nèi)循環(huán)延長可能與5%的CD47表達有關.
總之，CD47的表面顯示延長了NPs的血液循環(huán)，增強了NPs在腫瘤中的積累。
七、用于mPC處理的G/D-gETL NPs的表征CT26-Derived mPC異種移植
G/D-gETL NPs聯(lián)合HIPEC對ct26小鼠mPC模型的抗腫瘤作用瘤細胞接種后10 d，隨機分組(每組12只)，給予免費藥物或載藥NPs治療.腹腔穿刺取腹水后靜脈給予治療。對于參與HIPEC治療的組，在初始治療12小時后進行基于pt的HIPEC治療(圖8a)。第17天，小鼠按照同樣的程序接受第二周期治療，但不去除腹水。然后每3天監(jiān)測小鼠體重和腹圍的變化。到第30天，每個隊列中有5只小鼠被安樂死。采集血樣進行生化分析。收集腹水并測量。采用實驗性腹膜癌病指數(shù)(PCI)系統(tǒng)評估腫瘤負荷。其余的小鼠則繼續(xù)觀察存活情況
經(jīng)過兩個周期的治療，所有hipectreated組小鼠的體重和腹圍都穩(wěn)定。
HIPEC組小鼠腹水明顯減少，G/D-gETL NPs + HIPEC組腹水體積最小。相比之下，未加HIPEC的G/D-gETL NPs組腹水體積仍維持在較高水平.其他治療方案抑制作用明顯減弱，且G/D-gETL NPs + HIPEC治療組抑制率比HIPEC單獨治療組高2.6倍。HIPEC對控制腹水是有效的，而這種效果不能通過靜脈化療實現(xiàn).
雖然僅封裝GM-CSF或DTX在NPs中的治療效果優(yōu)于HIPEC，但封裝兩種藥物的配方產(chǎn)生了顯著更大的療效.
G/D-gETL NPs + HIPEC組小鼠中位生存期為53 d，比對照組或單藥組延長5 ~ 15 d.