MGMT基因重排有助于膠質(zhì)瘤化療耐藥

近月來，一篇名為“ MGMT genomic rearrangementscontribute to chemotherapy resistance in gliomas ”，發(fā)表在《Nature Communications》上，由CNIO的Seve Ballesteros基金會(huì)腦腫瘤小組負(fù)責(zé)人MassimoSquatrito博士和北京神經(jīng)病學(xué)研究所的Tao Jiang博士（醫(yī)學(xué)博士）領(lǐng)導(dǎo)。

“ MGMT啟動(dòng)子高甲基化是膠質(zhì)母細(xì)胞瘤患者中唯一已知的TMZ反應(yīng)生物標(biāo)記。在這里，我們顯示，復(fù)發(fā)性神經(jīng)膠質(zhì)瘤的一個(gè)子集攜帶MGMT基因組重排，導(dǎo)致MGMT過表達(dá)，與其啟動(dòng)子甲基化的變化無關(guān)。通過利用CRISPR / Cas9技術(shù)，我們?cè)谏窠?jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞中產(chǎn)生了一些MGMT重排，并證明MGMT基因組重排在體外和體內(nèi)均對(duì)TMZ產(chǎn)生了抗性。”

研究人員說：“在一組患者中觀察到了MGMT基因的移位?！?nbsp;這些基因組重排涉及MGMT與其他基因的融合，這意味著MGMT現(xiàn)在受到與其融合的啟動(dòng)子的調(diào)控，這有助于其過度表達(dá)。當(dāng)這種類型的重排發(fā)生時(shí)，替莫唑胺誘導(dǎo)的DNA損傷得到了非常有效的修復(fù)，并且即使在治療下，神經(jīng)膠質(zhì)瘤也繼續(xù)增長(zhǎng)。

為了揭示神經(jīng)膠質(zhì)瘤患者的TMZ耐藥情況，研究人員分析了252例經(jīng)TMZ治療的復(fù)發(fā)性神經(jīng)膠質(zhì)瘤的RNA測(cè)序數(shù)據(jù)，其中新收集了105例（42％）。然后，該團(tuán)隊(duì)整合了臨床信息并進(jìn)行了生物信息學(xué)分析，以確定幾種關(guān)鍵改變的突變狀態(tài)。CNIO小組使用CRISPR-Cas9在不同的細(xì)胞和動(dòng)物模型中復(fù)制了其中的一些易位，并證實(shí)它們可以賦予對(duì)替莫唑胺的抗性。研究人員補(bǔ)充說：“似乎在原始腫瘤中不存在易位，僅在復(fù)發(fā)性腫瘤中存在，即在治療原始癌癥后出現(xiàn)的腫瘤?！?nbsp;“這表明抗藥性可能是治療本身的結(jié)果?！?nbsp;

他們的發(fā)現(xiàn)可能會(huì)導(dǎo)致監(jiān)測(cè)治療效果的方法發(fā)生變化：“目前，膠質(zhì)瘤中唯一已知的治療生物標(biāo)志物是對(duì)MGMT啟動(dòng)子狀態(tài)的分析。甲基化后，MGMT基因沉默，預(yù)計(jì)患者對(duì)替莫唑胺有反應(yīng)。研究表明，當(dāng)發(fā)生基因易位時(shí)，該方法不再有效。該啟動(dòng)子可能仍然被阻斷，但是該基因被其他啟動(dòng)子過度激活，因此可能導(dǎo)致腫瘤復(fù)發(fā)?！?/span>

研究人員還發(fā)現(xiàn)外泌體中存在MGMT易位。研究人員指出，如果這一發(fā)現(xiàn)在患者中得到了驗(yàn)證，那么它將有助于早期發(fā)現(xiàn)耐藥性。研究人員的下一個(gè)目標(biāo)是為替莫唑胺耐藥的患者確定新的治療手段。

總而言之，替莫唑胺(TMZ)是一種口服烷基化劑，用于治療膠質(zhì)母細(xì)胞瘤，目前正在成為診斷為高危低級(jí)別膠質(zhì)瘤患者的化療選擇。o -6-甲基鳥嘌呤-DNA甲基轉(zhuǎn)移酶(MGMT)負(fù)責(zé)直接修復(fù)主要tmz誘導(dǎo)的毒性DNA加合物，即o6 -甲基鳥嘌呤病變。MGMT啟動(dòng)子高甲基化是目前已知的膠質(zhì)母細(xì)胞瘤患者TMZ反應(yīng)的唯一生物標(biāo)志物。此文章表明復(fù)發(fā)性膠質(zhì)瘤的一個(gè)子集攜帶MGMT基因組重排，導(dǎo)致MGMT過表達(dá)，獨(dú)立于其啟動(dòng)子甲基化的變化。通過利用CRISPR/Cas9技術(shù)，我們?cè)谀z質(zhì)瘤細(xì)胞中產(chǎn)生了一些MGMT重排，并證明MGMT基因組重排在體內(nèi)和體外都有助于TMZ耐藥。最后，證明了這種融合可以在腫瘤來源的外泌體中檢測(cè)到，并可能代表接受TMZ治療的患者中腫瘤復(fù)發(fā)的早期檢測(cè)標(biāo)志物。

技術(shù)路線： 

結(jié)果：

一、復(fù)發(fā)性膠質(zhì)瘤中MGMT基因融合的鑒定

通過分析252例復(fù)發(fā)性腦膠質(zhì)瘤的RNA-seq數(shù)據(jù)，我們?cè)?例患者中確定了8種不同的MGMT融合(約占所有患者的3%，95%可信區(qū)間，1.1 5.6%)。值得注意的是，在7例合并MGMT融合的患者中，有6例是女性，這明顯高于預(yù)期。重要的是，bootstrapping方法顯示MGMT低甲基化、DNA高突變和MGMT融合之間存在著顯著的相互排他性，表明這些變化在癌癥進(jìn)展中發(fā)揮著替代作用.

A. 總的來說，我們發(fā)現(xiàn)38.4%(245例)患者存在IDH1突變，9.4%(23例)患者存在1p/19q共缺失，38%(136例)患者存在MGMT啟動(dòng)子低甲基化，10.7%(27例)患者存在DNA高突變.

B. 對(duì)8種不同的MGMT重排進(jìn)行了深入研究:HGG中的BTRC-MGMT、CAPZB-MGMT、GLRX3-MGMT、NFYC-MGMT、RPH3A-MGMT和SAR1A-MGMT, LGG中的CTBP2- MGMT和FAM175B-MGMT. 8個(gè)伴侶基因中的5個(gè)位于染色體10q上，大部分接近MGMT

C. 盡管MGMT融合的左伴子不同，但MGMT轉(zhuǎn)錄組斷點(diǎn)始終位于MGMT起始密碼子上游12 bp處的MGMT外顯子2的邊界上。在三種重排(SAR1A-MGMT、RPH3A-MGMT和CTBP2-MGMT)中，MGMT編碼序列融合到融合伙伴的5 UTR上。重組嵌合轉(zhuǎn)錄本發(fā)現(xiàn)所有融合體均在框內(nèi)，MGMT的甲基轉(zhuǎn)移酶結(jié)構(gòu)域和dna結(jié)合結(jié)構(gòu)域均完整，提示MGMT的功能可能保留在融合蛋白中。

D-E我們利用PCR和Sanger測(cè)序在有足夠標(biāo)本的樣本中驗(yàn)證了基因融合。對(duì)于一個(gè)患者(CGGA_1729)，我們進(jìn)行了全基因組測(cè)序(WGS)，該樣本的結(jié)構(gòu)重排分析顯示，大約4.8 Mb的缺失導(dǎo)致FAM175B-MGMT融合.

二、MGMT基因重排導(dǎo)致MGMT過表達(dá)

A.為了產(chǎn)生攜帶MGMT融合的細(xì)胞系，我們首先將U251和U87細(xì)胞，兩種MGMT甲基化的GBM細(xì)胞系，與慢病毒載體表達(dá)不同的gRNA對(duì)組合，指向四種不同的MGMT重排:BTRC-MGMT、NFYC-MGMT、SAR1A-MGMT和CTBP2-MGMT(補(bǔ)充圖2a c)。

通過PCR在基因組水平檢測(cè)到預(yù)期的染色體重排，并通過Sanger測(cè)序證實(shí)。然后將新生成的細(xì)胞群暴露于TMZ中。存活的克隆只在攜帶不同融合事件的細(xì)胞群體中觀察到，而在對(duì)照細(xì)胞中沒有觀察到(sgCtrl，非靶向sgRNA).

B.TMZ耐藥可能是由于MGMT表達(dá)增加導(dǎo)致的，因?yàn)橹嘏艑GMT基因置于一個(gè)更活躍的啟動(dòng)子控制之下。實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果顯示，MGMT在攜帶不同融合體的無性系中表達(dá)量顯著增加。

與對(duì)照細(xì)胞相比，MGMT啟動(dòng)子甲基化狀態(tài)沒有變化，甲基化特異性PCR (MSP)證實(shí)了這一點(diǎn)。這些結(jié)果與在患者隊(duì)列中觀察到的結(jié)果一致:MGMT重排的患者顯示MGMT表達(dá)升高，同時(shí)MGMT啟動(dòng)子甲基化。

使用抗gmt抗體進(jìn)行Western blot分析，發(fā)現(xiàn)MGMT在蛋白水平上明顯過表達(dá)，SAR1A-MGMT和CTBP2-MGMT融合克隆尤其明顯(圖2d)。此外，MGMT表達(dá)的不同水平可能由參與融合事件的特定基因s啟動(dòng)子的活性和/或每個(gè)特定克隆基因組重排列的拷貝數(shù)決定。 

三、MGMT基因融合有助于TMZ耐藥

為了確定攜帶融合基因的克隆對(duì)TMZ的抗性是否由一種全功能MGMT蛋白的過表達(dá)決定，而不是由TMZ治療過程中獲得的其他突變引起的，我們分析了O6-芐基鳥嘌呤(O6- bg)對(duì)TMZ的敏感性，O6- bg是鳥嘌呤的一種合成衍生物，可抑制MGMT活性。

A.對(duì)2個(gè)獨(dú)立的U251克隆進(jìn)行克隆實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明，與O6-BG共處理后，TMZ的敏感性得以恢復(fù)。

B-D.相比之下，錯(cuò)配修復(fù)基因MSH6(一種獨(dú)立于MGMT表達(dá)的tmz耐藥機(jī)制)的細(xì)胞敲除在O6-BG存在下也完全耐TMZ。同樣，碘化丙啶染色和EdU摻入分析顯示融合克隆避開了tmz誘導(dǎo)的G2/M期積累，O6-BG共處理能夠重新建立細(xì)胞周期停滯。

E-F.高通量顯微鏡定量分析顯示，與sgRNA MSH6細(xì)胞相似，TMZ處理未增加γH2AX和53BP1病灶水平，這是DNA雙鏈斷裂細(xì)胞特有的DNA損傷標(biāo)志物.

總之，O6-BG抑制MGMT導(dǎo)致TMZ處理后融合克隆中γH2AX和53BP1焦點(diǎn)的積累。MGMT基因重排誘導(dǎo)的TMZ抗性與MGMT活性存在機(jī)制方面的聯(lián)系。

四、MGMT基因融合在體內(nèi)對(duì)TMZ治療有保護(hù)作用

通過U251 BTRC-MGMT和對(duì)照細(xì)胞建立nu/nu小鼠異種移植模型，體內(nèi)MGMT融合的TMZ耐藥性，之前用表達(dá)熒光素酶的構(gòu)建物轉(zhuǎn)染。顱內(nèi)移植后1周，小鼠腹腔注射TMZ (50 mg/ Kg)或DMSO(0.3%) 5天，每周用生物熒光成像(BLI)監(jiān)測(cè)腫瘤生長(zhǎng)情況，連續(xù)4周。

AMGMT帶有融合腫瘤的小鼠在TMZ組和DMSO組之間沒有顯示出顯著的壽命延長(zhǎng)，并且在接受TMZ治療時(shí)，與對(duì)照組小鼠相比，生存率顯著下降.

TMZ治療顯著延長(zhǎng)了sgCtrl轉(zhuǎn)導(dǎo)h543的小鼠移植后的存活時(shí)間，但未能延長(zhǎng)表達(dá)SAR1A-MGMT重排的小鼠的存活時(shí)間(補(bǔ)充圖7h)。BLI分析證實(shí)TMZ對(duì)正常小鼠的抗腫瘤作用有限.

免疫組化顯示TMZ給藥后，BTRC-MGMT小鼠BrdU摻入增加，γH2AX積累減少.

評(píng)估MGMT融合是否可以在EXOs中檢測(cè)到。用標(biāo)準(zhǔn)的超離心法從含有SAR1A-MGMT和sgCtrl的條件培養(yǎng)基中純化了EXOs。蛋白質(zhì)含量的Western blot證實(shí)了外泌體特異性標(biāo)記TSG101和Alix在外泌體中富集. MGMT在表達(dá)融合事件的細(xì)胞中的存在(圖4d)。

RT-PCR檢測(cè)到MGMT融合的mRNA在EXOs中(圖4e)。

原位注射U251 BTRC-MGMT細(xì)胞的小鼠血清中分離的外顯子是否也表現(xiàn)出融合轉(zhuǎn)錄。值得注意的是，RTPCR分析證實(shí)了btrc - mgmt衍生的循環(huán)血液外顯子中存在cDNA融合片段.