人臍帶血來源的MSCs外泌體通過抑制鐵死亡緩解急性心肌梗死小鼠心肌損傷

急性心肌梗死(Acute myocardial infarction, AMI)常因氧和血供突然減少而引起心肌損傷和心力衰竭，是發(fā)病和死亡的主要原因之一。鐵死亡是一種氧化的、依賴鐵的細(xì)胞死亡形式，不同于壞死、凋亡和自噬。

細(xì)胞內(nèi)谷胱甘肽(GSH)依賴的抗氧化防御系統(tǒng)失活，導(dǎo)致毒性脂質(zhì)活性氧(ROS)的積累，從而導(dǎo)致鐵細(xì)胞膜下垂。據(jù)報道，鐵tosis可發(fā)生在缺血再灌注(I/R)損傷、癌癥等。鐵死亡是心肌細(xì)胞死亡的一種重要形式。ferroptosis在急性心肌梗死中起重要作用。人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞(hub -MSCs)因其免疫原性低、增殖因子高、轉(zhuǎn)染效率高，具有廣闊的應(yīng)用前景。有報道稱，HUCBMSCs來源的外泌體緩解了AMI損傷。那么，間充質(zhì)干細(xì)胞外泌體是否對AMI中ferroptosis有調(diào)節(jié)作用呢?二價金屬轉(zhuǎn)運(yùn)體DMT1 (Slc11a2)作為復(fù)雜生理過程的關(guān)鍵組成部分，可以調(diào)節(jié)體內(nèi)鐵的水平。在哺乳動物中，dmt1是一種鐵(2+)的轉(zhuǎn)運(yùn)體，對適當(dāng)維持鐵的穩(wěn)態(tài)至關(guān)重要。有鑒于此，河南省人民醫(yī)院，阜外中華心血管病醫(yī)院麻醉科的Yufang Song、河南省人民醫(yī)院阜外中國中部心血管醫(yī)院心血管外科Zhenwei Ge等研究人員，探討DMT1在AMI體外和體內(nèi)模型中的表達(dá)及作用。

據(jù)報道，人臍血來源的MSCs外泌體對急性心肌梗死(AMI)和心肌細(xì)胞缺氧損傷小鼠模型有心肌保護(hù)作用，但具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

本文旨在研究hucb - msc -外泌體抑制鐵死亡減輕心肌損傷的作用。RT-PCR和western blotting結(jié)果顯示，與假手術(shù)組和常氧組比較，二價金屬轉(zhuǎn)運(yùn)體1 (DMT1)表達(dá)顯著升高，Prussian藍(lán)染色、鐵離子(Fe2+)、MDA和GSH水平檢測結(jié)果顯示，缺氧損傷后心肌梗死和心肌細(xì)胞出現(xiàn)鐵死亡。過表達(dá)DMT1促進(jìn)H/ r誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞鐵死亡，而敲除DMT1則顯著抑制了心肌細(xì)胞鐵死亡。hub - msc來源的外泌體抑制了鐵死亡和減少心肌損傷，miR-23a- 3p敲除后在外泌體中消失。雙熒光素酶報告基因?qū)嶒?yàn)證實(shí)DMT1是miR-23a-3p的靶基因。綜上所述，hucb - mscs -外泌體可能通過miR-23a-3p抑制DMT1的表達(dá)，從而抑制鐵死亡，減輕心肌損傷。 

技術(shù)路線：

結(jié)果：

一、在AMI小鼠中上調(diào)DMT1的表達(dá)并增加鐵死亡

B.建立小鼠AMI模型，分別于術(shù)后1 h、4 h、12 h、24 h、48 h采集左心室心肌組織。RT-PCR和western blot結(jié)果顯示，AMI小鼠24 h和48 h時DMT1表達(dá)明顯高于假手術(shù)組，而GPX4蛋白表達(dá)降低.表明AMI模型建立后24 h DMT1明顯上調(diào)。

C.使用Prussian藍(lán)染色和鐵檢測試劑盒，AMI小鼠在12 h、24 h和48 h鐵沉積和亞鐵(Fe2+)水平增加(圖1c、d)。

D.AMI小鼠24 h和48 h MDA水平升高，GSH水平和GPX4活性均下降。提示AMI模型LAD后24 h可出現(xiàn)心肌組織鐵死亡。

A-B.用H/R處理新生小鼠心肌細(xì)胞，并轉(zhuǎn)染攜帶DMT1表達(dá)序列/DMT1干擾序列或陰性對照的慢病毒。與對照組相比，H/R組DMT1 mRNA和蛋白表達(dá)水平均上調(diào)(圖2a, b)。

C. 在H/R處理下，細(xì)胞活力測定和形態(tài)學(xué)的變化顯示，過表達(dá)DMT1進(jìn)一步降低了細(xì)胞活力，而敲除DMT1則明顯提高了細(xì)胞活力(圖2c)。

D. 正常心肌細(xì)胞偽足相互接觸呈放射狀排列，H/R處理使細(xì)胞突觸變薄、收縮、胞漿萎縮。在H/R處理下，DMT1過表達(dá)進(jìn)一步引起細(xì)胞凋亡，核染色質(zhì)凝集碎裂，細(xì)胞收縮，而DMT1敲除明顯改善細(xì)胞質(zhì)收縮(圖2d)。

G,H. 流式細(xì)胞儀分析數(shù)據(jù)顯示，H/R誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，過表達(dá)DMT1進(jìn)一步加重細(xì)胞凋亡，而敲除DMT1則顯著抑制細(xì)胞凋亡.

F,J-K . H/R組細(xì)胞內(nèi)ROS水平、鐵沉積、亞鐵(Fe2+)、MDA水平均升高，過表達(dá)DMT1進(jìn)一步提高了H/ r誘導(dǎo)的ROS水平、鐵沉積、亞鐵(Fe2+)和MDA水平，而敲除DMT1則顯著降低了H/ r誘導(dǎo)的ROS水平、鐵沉積、亞鐵(Fe2+)和MDA水平.

H/R組發(fā)現(xiàn)GSH水平和GPX4活性降低，過表達(dá)DMT1進(jìn)一步降低GSH水平，而敲除DMT1則顯著提高GSH水平(圖2l)。

DMT1對GPX4活性無顯著影響(圖2m)。

這些數(shù)據(jù)表明，DMT1過表達(dá)促進(jìn)H/ r誘導(dǎo)的細(xì)胞鐵死亡，而敲除DMT1則顯著抑制H/ r誘導(dǎo)的細(xì)胞鐵死亡。 

二、HUCB-MSCs和外泌體的分離與鑒定

為了證明hub - mscs衍生的外泌體可以改變心肌細(xì)胞的基因表達(dá)。證明了外泌體可以被心肌細(xì)胞吸收。標(biāo)記PKH67的hucb - mscs外泌體加入心肌細(xì)胞培養(yǎng)液中。孵育6 h后如圖3f所示，大部分心肌細(xì)胞獲得了pkh67標(biāo)記的外泌體，hucb - mscs外泌體在心肌細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中分布相似。

三、hub - msc衍生的外泌體可傳遞miR-23a-3p來抑制ferroptosis

A-B.miR-23a-3p在形成的外泌體中被成功敲低。為了進(jìn)一步研究外泌體對心肌細(xì)胞ferroptosis的影響，構(gòu)建H/ r誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞，模擬體外心肌損傷.

C-D. H/ r誘導(dǎo)的細(xì)胞中miR-23a-3p表達(dá)降低，而與外泌體共培養(yǎng)的心肌細(xì)胞中miR-23a-3p表達(dá)升高。與hucbmscs -外泌體共培養(yǎng)的心肌細(xì)胞中，DMT1 mRNA和蛋白表達(dá)與miR-23a-3p相反.

E-M.過表達(dá)DMT1可進(jìn)一步降低H/ r處理心肌細(xì)胞的細(xì)胞活力和GSH水平，增加細(xì)胞凋亡、細(xì)胞內(nèi)ROS水平、鐵沉積、亞鐵(Fe2+)和MDA水平。圖4e -m所示的結(jié)果與DMT1表達(dá)的變化趨勢相同，說明DMT1是hub - mscs來源的外泌體傳遞miR-23a-3p抑制ferroptosis的關(guān)鍵靶點(diǎn)之一。mir -23a-3p耗損HUCB-MSCs外泌體在心肌細(xì)胞鐵質(zhì)下垂中發(fā)揮微弱的抑制作用，與NCI-Exo組相比，細(xì)胞活力和GSH水平降低，細(xì)胞凋亡、細(xì)胞內(nèi)ROS水平、鐵沉積、亞鐵(Fe2+)和MDA水平升高.

N. hub - msc -外泌體對GPX4的活性沒有顯著影響(圖4n)。

總之，hucb - msc衍生的外泌體傳遞miR-23a-3p抑制鐵死亡。

四、hucb - mscs來源的表達(dá)mir -23a-3p的外泌體通過靶向DMT1抑制了ferroptosis

A.     Starbase軟件預(yù)測了miR-23a-3p與DMT1的3 UTR的結(jié)合關(guān)系。

B.     轉(zhuǎn)染miR-23a-3p mimic的細(xì)胞在DMT1- WT共轉(zhuǎn)染體系中熒光素酶活性降低，而在DMT1- mut共轉(zhuǎn)染體系中無明顯變化，說明miR-23a-3p與DMT1直接結(jié)合。

C.     用hucb - msc -外泌體孵育時，用過表達(dá)的DMT1慢病毒感染心肌細(xì)胞。DMT1 mRNA和蛋白表達(dá)水平在ExoVector組降低，Exo + DMT1組升高，提示hubmscs -外泌體對DMT1表達(dá)的負(fù)調(diào)控作用(圖5b)。

D.    過表達(dá)DMT1慢病毒感染后，hucbmscs -外泌體誘導(dǎo)的細(xì)胞活力升高和GSH水平降低，細(xì)胞凋亡減少，細(xì)胞內(nèi)ROS水平、鐵沉積、亞鐵(Fe2+)、MDA水平升高,表明hucbmscs來源的表達(dá)mir -23a-3p的外泌體通過靶向DMT1抑制了ferroptosis。

五、hucb - mscs -外泌體對AMI小鼠心肌細(xì)胞的鐵死亡有抑制作用

E.     TTC染色顯示hucb - msc -外泌體減輕AMI小鼠梗死面積，而miR-23a-3pI-Exo減輕AMI小鼠梗死面積的作用明顯減弱.

F.      hucbmscs -外泌體給藥可減輕心肌損傷，而miR-23a-3pI-Exo給藥可明顯減弱減輕AMI小鼠心肌損傷的作用。

G.    心肌梗死小鼠心肌組織中tunel陽性細(xì)胞比例顯著增加HUC bmscs -外泌體的植入可以消除這種現(xiàn)象。然而，miR-23a-3pI-Exo移植比NCI-Exo移植具有更高的凋亡指數(shù).

D.HUCB-MSCs外泌體明顯抑制DMT1表達(dá)、鐵沉積、亞鐵(Fe2+)和MDA水平，上調(diào)GSH水平，但miR-23a-3pI-Exo對這些的作用明顯減弱。

E. HUCB-MSCsexosomes對AMI小鼠GPX4活性沒有顯著影響(圖7f)。這些結(jié)果表明HUCB-MSCs外泌體抑制了鐵死亡。