支鏈氨基酸轉(zhuǎn)氨酶2在癌細(xì)胞中調(diào)節(jié)鐵死亡

2020年10月江蘇大學(xué)附屬醫(yī)院Haitao Zhu教授于Cell Death & Differentiation上發(fā)表文章Branched-chain amino acid aminotransferase 2 regulates ferroptotic cell death in cancer cells其研究發(fā)現(xiàn)確認(rèn)了BCAT2在鐵死亡中的新作用，提示了一種克服索拉非尼耐藥的潛在治療策略。

鐵死亡是一種由細(xì)胞氧化還原穩(wěn)態(tài)喪失引起的細(xì)胞凋亡，導(dǎo)致脂質(zhì)過氧化失控，最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡。胱氨酸-谷氨酸抗氧化劑(系統(tǒng)Xc)或谷胱甘肽過氧化物酶4 (GPX4)的藥理失活可誘導(dǎo)鐵死亡增多，提示谷胱甘肽依賴的抗氧化防御在防止鐵死亡細(xì)胞死亡中起關(guān)鍵作用。鐵死亡作用與缺血引起的器官損傷、與退行性疾病相關(guān)的病理細(xì)胞死亡以及不同類型的癌癥有關(guān)。多種腫瘤細(xì)胞易發(fā)生鐵死亡增多，包括淋巴瘤、宮頸癌、頭頸癌、胰腺癌、腎細(xì)胞癌和肝細(xì)胞癌。各種研究證實(shí)了鐵亡誘導(dǎo)劑的關(guān)鍵作用，包括小分子鐵亡誘導(dǎo)劑如伊拉斯汀，以及許多藥物(如索拉非尼、青蒿素及其衍生物)在殺傷腫瘤細(xì)胞和抑制腫瘤方面的作用增長(zhǎng)。這些鐵死亡誘導(dǎo)劑還可與化療藥物協(xié)同治療腫瘤。有趣的是，有些類型的癌癥對(duì)鐵死亡誘導(dǎo)劑比其他類型的更敏感。反向過硫通路已被確定為鐵死亡作用的負(fù)調(diào)節(jié)因子，卵巢癌細(xì)胞中缺乏該通路與伊拉斯汀誘導(dǎo)的鐵死亡敏感性增高有關(guān)。HSF1-HSPB1通路也在人宮頸癌、前列腺癌和骨肉瘤中負(fù)調(diào)控星抑素誘導(dǎo)的鐵死亡作用。MUC1-C/xCT通路是伊拉斯汀誘導(dǎo)的三陰性乳腺癌細(xì)胞鐵胞作用的另一個(gè)負(fù)調(diào)控因子。

越來越多的證據(jù)表明，細(xì)胞代謝在鐵死亡中起著至關(guān)重要的作用[12,13]。轉(zhuǎn)錄因子NRF2協(xié)調(diào)抗氧化防御系統(tǒng)調(diào)節(jié)鐵死亡作用。p62- Keap1-NRF2是[14]肝癌細(xì)胞上鐵死亡的中樞抑制通路?；蚧蛩幬镆种芅RF2顯著增強(qiáng)鐵死亡 伊拉斯汀引起的肝癌易感性和索拉非尼,而NRF2表達(dá)式led的激活細(xì)胞抵抗鐵死亡,建議中央部分含氧降低分子的作用,特別是活性氧(ROS)在鐵死亡。細(xì)胞內(nèi)的鐵代謝對(duì)鐵依賴氧化酶或芬頓化學(xué)作用也是必不可少的。最近的一項(xiàng)研究表明，鐵死亡的自噬降解通過自噬貨物受體核受體共激活因子4 (NCOA4)調(diào)節(jié)鐵死亡的作用。不足為奇的是，氨基酸代謝也參與了鐵死亡。高濃度的胞外谷氨酸，伊拉斯汀，或其他系統(tǒng)Xc抑制劑阻斷胞內(nèi)胱氨酸/半胱氨酸攝取，以誘導(dǎo)鐵死亡。沉默cysteinyltRNA合成酶(CARS)可上調(diào)經(jīng)硫途徑，從而導(dǎo)致對(duì)伊拉斯汀誘導(dǎo)的鐵死亡的抗性。谷氨酰胺通過其特定的代謝酶谷氨酰胺酶(GLS1和GLS2)介導(dǎo)鐵死亡作用，但谷氨酰胺分解過程的機(jī)制復(fù)雜。然而，在肝癌細(xì)胞中控制鐵死亡敏感性的代謝途徑尚不清楚。在本研究中，作者鑒定了支鏈氨基酸氨基轉(zhuǎn)移酶2 (BCAT2)，一種氨基轉(zhuǎn)移酶催化硫氨基酸代謝，作為鐵死亡的特異性抑制劑。作者發(fā)現(xiàn)BCAT2參與了Xc系統(tǒng)抑制物誘導(dǎo)的肝癌細(xì)胞鐵死亡作用。此外，BCAT2還參與了磺胺嘧啶與索拉非尼協(xié)同誘導(dǎo)鐵死亡的機(jī)制。因此，作者的研究結(jié)果表明BCAT2是鐵死亡的抑制因子，并參與了肝癌鐵死亡的核心代謝信號(hào)通路。

在這項(xiàng)研究中，作者證實(shí)了伊拉斯汀、索拉非尼或磺胺嘧啶激活了鐵死亡，增加了細(xì)胞不穩(wěn)定鐵的水平。細(xì)胞內(nèi)高水平的不穩(wěn)定鐵導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)ROS的快速積累，這是鐵中毒的必要條件。有趣的是，作者發(fā)現(xiàn)該噬鐵途徑也激活A(yù)MPK磷酸化，從而抑制SREBP1的核易位，并抑制其直接靶基因BCAT2的轉(zhuǎn)錄(圖5)。作者進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，BCAT2通過調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)谷氨酸水平抑制了細(xì)胞內(nèi)的鐵死亡。重要的是，在體外和一些動(dòng)物模型中，如皮下胰腺癌模型、原位肝癌模型和PDX肝癌模型中，硫柳氮嗪與索拉非尼的聯(lián)合在抑制BCAT2表達(dá)和促進(jìn)鐵毒性癌細(xì)胞死亡方面具有協(xié)同作用。重要的是，在這些臨床前癌癥模型中，BCAT2也顯示出作為評(píng)估藥物反應(yīng)的敏感生物標(biāo)志物的潛力。BCAT2控制鐵死亡的發(fā)現(xiàn)與氨基酸在[21]鐵死亡中起關(guān)鍵作用的概念一致。BCAT是關(guān)鍵的代謝蛋白，催化BCAA的可逆轉(zhuǎn)氨基反應(yīng)生成各自的a-酮酸(BCKAs)和谷氨酸，負(fù)責(zé)生成30%的從頭腦谷氨酸。谷氨酸的代謝與鐵死亡的調(diào)控密切相關(guān)。值得注意的是，Xc系統(tǒng)的功能是由谷氨酸水平調(diào)節(jié)的，因?yàn)樵赬c系統(tǒng)中谷氨酸以1:1的比例交換胱氨酸。因此，細(xì)胞外高濃度的谷氨酸阻斷系統(tǒng)Xc活性，抑制胱氨酸攝取，并驅(qū)動(dòng)鐵死亡。相比之下，作者體外實(shí)驗(yàn)中細(xì)胞內(nèi)高水平的谷氨酸來源于BCAT2驅(qū)動(dòng)的谷氨酸的重新合成，從而可能增強(qiáng)系統(tǒng)Xc活性，促進(jìn)胱氨酸攝取，抑制鐵亡。BCAT2細(xì)胞內(nèi)谷氨酸代謝的這種保護(hù)作用與細(xì)胞外腦谷氨酸水平降低對(duì)Xc敲除小鼠神經(jīng)毒性損傷的保護(hù)作用是一致的。此外，作者的實(shí)驗(yàn)證實(shí)了BCAT2的表達(dá)水平受到AMPK-SREBP1信號(hào)通路的調(diào)控，這也得到了之前在胰腺癌[18]中BCAT2基因組缺失導(dǎo)致側(cè)死的發(fā)現(xiàn)的支持。作為代謝應(yīng)激的關(guān)鍵傳感器，AMPK在鐵死亡作用中的作用與環(huán)境有關(guān)。AMPK通過介導(dǎo)BECN1磷酸化和BECN1- slc7a11復(fù)合物的形成，從而促進(jìn)癌細(xì)胞的鐵死亡，這與作者發(fā)現(xiàn)的鐵死亡抑制劑通過激活A(yù)MPK而下調(diào)BCAT2表達(dá)的研究結(jié)果一致。有趣的是，作者注意到最近的報(bào)道，能量應(yīng)力介導(dǎo)的AMPK激活抑制了鐵死亡作用。AMPK在鐵死亡中作用的差異可能與被測(cè)細(xì)胞系的基礎(chǔ)AMPK活性和環(huán)境背景有關(guān)。因此，AMPK在癌癥鐵死亡中的潛在作用值得深入研究，也為腫瘤患者提供了一種重要的治療策略。

BCAA是合成谷氨酸和谷氨酰胺的氮供體，但谷氨酰胺在鐵死亡中的作用是復(fù)雜的。谷氨酰胺是通過其特殊的代謝-谷氨酰胺分解來降解的。當(dāng)glutaminolysis抑制或谷氨酰胺耗盡，胱氨酸饑餓和阻斷胱氨酸進(jìn)口均不能誘導(dǎo)ROS積累、脂質(zhì)過氧化和鐵死亡增多，說明谷氨酰胺溶解是鐵死亡增多的燃料。根據(jù)這一觀察，除谷氨酰胺外，谷氨酰胺分解的另一產(chǎn)物a-酮戊二酸(a-KG)可替代谷氨酰胺誘導(dǎo)鐵死亡。作者推測(cè)BCAT催化BCAAs-BCKAs穿梭合成谷氨酸，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)a- kg水平降低，這可能是引起鐵死亡的另一個(gè)原因。敲除BCAT2對(duì)SLC7A11的表達(dá)無影響。因此，BCAT2與系統(tǒng)Xc之間的確切關(guān)系需要在今后的工作中進(jìn)行更深入的研究。肝癌是全球癌癥死亡的第三大原因，而標(biāo)準(zhǔn)的化療對(duì)大多數(shù)肝癌患者并沒有效果，醫(yī)生一直在尋找靶向療法。索拉非尼是唯一的多激酶抑制劑作為一線治療被證明可以延長(zhǎng)不可切除的HCC[26]的總生存率。然而，來自亞太地區(qū)服用索拉非尼的患者的總生存率僅為6.5個(gè)月，反應(yīng)率低為2%。

最近，最近的一項(xiàng)三期臨床研究中，其總體生存優(yōu)勢(shì)并沒有超過索拉非尼。在這項(xiàng)研究中，作者發(fā)現(xiàn)磺胺嘧啶單獨(dú)或與索拉非尼聯(lián)合，在二鐵誘導(dǎo)療法中發(fā)揮作用。這些發(fā)現(xiàn)是相應(yīng)的，因?yàn)榛前粪奏な且环N抗炎藥物，已經(jīng)廣泛用于炎癥性腸病的慢性、長(zhǎng)期治療，保證了其在成人和兒童中的安全性。基于作者的研究結(jié)果，磺胺嘧啶可能是晚期肝癌以及其他無法切除的癌癥的一種潛在的新治療選擇。由于治療中表達(dá)的變化，BCAT2可能是最敏感的靶點(diǎn)之一，其表達(dá)可作為預(yù)測(cè)索拉非尼和磺胺嘧啶聯(lián)合治療反應(yīng)的標(biāo)志物。然而，這一假設(shè)應(yīng)該在患者資料中進(jìn)行評(píng)估。綜上所述，作者的數(shù)據(jù)表明，抑制細(xì)胞內(nèi)谷氨酸的合成可以作為在癌癥背景下誘導(dǎo)鐵死亡依賴性的一個(gè)好策略。作者的研究結(jié)果支持了這一觀點(diǎn)，即硫磺胺嘧啶與索拉非尼協(xié)同下調(diào)BCAT2，從而下調(diào)細(xì)胞內(nèi)的谷氨酸。作者的工作還表明，細(xì)胞殺傷機(jī)制涉及調(diào)控從頭合成谷氨酸是肝癌細(xì)胞的關(guān)鍵過程。作者認(rèn)為BCAT2的蛋白或mRNA水平可用于預(yù)測(cè)癌細(xì)胞對(duì)未來鐵運(yùn)誘導(dǎo)療法的反應(yīng)性。作者還提出，高特異性的BCAT2抑制劑可以為一部分有意義的癌癥患者提供有效的治療。

技術(shù)路線：

一、用kinome CRISPRa篩選鑒定鐵死亡的新作用以及Ferroptosis誘導(dǎo)物通過ferritinophagy-AMPK-SREBP1通路抑制BCAT2的表達(dá)

A. 為了系統(tǒng)闡明ferroptosis下游保守負(fù)調(diào)控因子，我們進(jìn)行了大規(guī)模的基因CRISPR激活(CRISPRa)篩選。靶向2320激酶、磷酸酶和藥物靶點(diǎn)(https://www.addgene.org/ pooled-library/weissman-human CRISPRa -v2-subpools/)的pooled人CRISPRa sgRNA慢病毒庫和Cas9-VPR酶通過慢病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)引入HepG2細(xì)胞，然后用erastin處理或?qū)φ誅MSO處理.富集sgRNAs的基因靶點(diǎn)是在HepG2細(xì)胞中賦予erastin介導(dǎo)的ferroptosis抗性的潛在基因。在我們的篩選方法中，許多報(bào)道的ferroptosis基因被鑒定和驗(yàn)證。其中分支的BCAT2是ferroptosis潛在負(fù)調(diào)控因子的首選基因.

B. 在ferroptosis誘導(dǎo)劑處理后，BCAT2的蛋白和mrna表達(dá)水平有所下降，但BCAT1 (BCAT2的同源物)沒有下降，

在甲磺酸二鐵胺(DFO，一種ferroptosis抑制劑)的存在下被逆轉(zhuǎn)。

C. 推測(cè)ferroptosis誘變劑通過AMPK-SREBP1信號(hào)通路下調(diào)BCAT2。通過western blotting定量分析，erastin、sorafenib或s ulfasalazine誘導(dǎo)了蘇氨酸殘基172 (T172)上AMPK磷酸化，并降低了SREBP1的表達(dá)(圖1C、S4A和S4B)。

D. ChIP實(shí)驗(yàn)還顯示，erastin、sorafenib或sulfasalazine存在時(shí)，SREBP1與BCAT2的結(jié)合顯著減少.

E. AMPK激活劑AICAR下調(diào)Aspc-1和HepG2癌細(xì)胞中BCAT2的表達(dá)方式與erastin、sorafenib或sulfasalazine類似，AMPK抑制劑化合物C可逆轉(zhuǎn)這一過程，進(jìn)一步證實(shí)了ferroptosis誘變劑通過激活A(yù)MPK下調(diào)BCAT2的表達(dá).

二、BCAT2是癌細(xì)胞鐵死亡的抑制因子

A.考慮到鐵在鐵死亡中的關(guān)鍵作用，我們首先研究了BCAT2表達(dá)與鐵積累的相關(guān)性。

與預(yù)期的一樣，erastin、sorafenib或sulfasalazine處理在對(duì)照組和BCAT2轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中都誘導(dǎo)了游離鐵的積累.

B.  erastin, sorafenib, and sulfasalazine 處理后，Aspc-1和HepG2細(xì)胞的GSH水平受到抑制，BCAT2的異位表達(dá)恢復(fù)了GSH水平.

C.與親代細(xì)胞相比，erastin, sorafenib, and sulfasalazine處理后，脂質(zhì)過氧化的終產(chǎn)物丙二醛(MDA)水平在Aspc- 1和HepG2細(xì)胞中升高，而過表達(dá)bcat2的細(xì)胞中降低(圖2C和S8D)。

D-F.與這些結(jié)果一致，在erastin, sorafenib, and sulfasalazine存在下，BCAT2過表達(dá)增加了細(xì)胞內(nèi)谷氨酸(圖2D和S8E)和谷氨酸釋放(圖2E和S8F)，并以時(shí)間依賴的方式減少了 system Xc抑制劑誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡(圖2F和S8G).

G-L.在erastin, sorafenib, and sulfasalazine存在的情況下，敲除BCAT2-顯著增加了Aspc-1和HepG2細(xì)胞中MDA的生成(圖2H和S11D)和GSH的消耗(圖2I和S11E)，但對(duì)游離細(xì)胞鐵的積累沒有影響(圖2G和S11C)。此外，BCAT2在erastin, sorafenib, and sulfasalazine存在下，下調(diào)細(xì)胞內(nèi)谷氨酸水平(圖2J和S11F)，谷氨酸釋放(圖2K和S11G)以及細(xì)胞活力(圖2L和S11H)。用RSL3和BSO處理親代和BCAT2敲除Aspc-1和HepG2細(xì)胞，顯示出相似的結(jié)果(圖S12)。因此，BCAT2沉默細(xì)胞的集落形成能力受到抑制(圖S11I)。敲除BCAT2并不影響Aspc-1和HepG2細(xì)胞中SLC7A11和GPX4蛋白的表達(dá)水平(圖S13A)。這些結(jié)果表明，BCAT2敲低可部分誘導(dǎo)鐵死亡。

三、BCAT2參與sulfasalazine和 sorafenib協(xié)同誘導(dǎo)鐵死亡的機(jī)制

A-E.sorafenib and sulfasalazine聯(lián)合應(yīng)用可顯著抑制Aspc-1和HepG2細(xì)胞中BCAT2的表達(dá)(圖3A)，與sorafenib and sulfasalazine單獨(dú)聯(lián)合BCAT2 shRNA的模式相似(圖2M和S11J)。sorafenib and sulfasalazine在增加細(xì)胞死亡(圖3B)和MDA生成方面也表現(xiàn)出協(xié)同作用，在ferrostatin-1 存在時(shí)可以恢復(fù)這一作用(圖3C)，抑制細(xì)胞內(nèi)谷氨酸水平(圖3D),谷氨酸釋放(圖3E)。

總之，sorafenib and sulfasalazine通過部分調(diào)節(jié)BCAT2表達(dá)對(duì)ferroptosis的影響。

在C57BL/6小鼠中，在C57BL/6小鼠中，sorafenib and sulfasalazine分別減少了9.63%和13.5%的Panc02皮下腫瘤大小，聯(lián)合治療在第14天進(jìn)一步減少了81.39%的腫瘤大小(圖4A-C)。

由于原位異種移植模型在復(fù)制腫瘤微環(huán)境和預(yù)測(cè)藥物療效方面被認(rèn)為優(yōu)于皮下腫瘤模型，

在C57BL/6小鼠H22細(xì)胞的原位HCC模型中，我們想驗(yàn)證 sulfasalazine誘導(dǎo)鐵死亡是否也能增強(qiáng)索拉非尼的抗癌活性(圖4D)。

sorafenib and sulfasalazine顯著減小了原位異種移植瘤的腫瘤大小(圖4E)，延長(zhǎng)了動(dòng)物存活時(shí)間(圖4F)。

此外，sorafenib and sulfasalazine聯(lián)合治療顯著降低了蛋白和mrna表達(dá)水平中的BCAT2(圖s)。S14A和S14B)，

原位HCC組織中GSH水平降低(圖S14C)， MDA水平升高(圖S14D)。在C57BL/6小鼠H22細(xì)胞的原位HCC模型中，我們想驗(yàn)證磺胺吡啶誘導(dǎo)二茂鐵tosis是否也能增強(qiáng)索拉非尼的抗癌活性(圖4D)。的確，索拉非尼聯(lián)合柳氮磺胺吡啶顯著減小了原位異種移植瘤的腫瘤大小(圖4E)，延長(zhǎng)了動(dòng)物存活時(shí)間(圖4F)。

此外，索拉非尼和柳氮磺胺嘧啶聯(lián)合治療顯著降低了蛋白和mrna表達(dá)水平中的BCAT2(圖s)。S14A和S14B)，原位HCC組織中GSH水平降低(圖S14C)， MDA水平升高(圖S14D)。

為了揭示更多的臨床相關(guān)性,我們轉(zhuǎn)向patient-derived異種移植(pdx)模型,已應(yīng)用于臨床前藥物檢測(cè)在許多類型的癌癥由于其生物穩(wěn)定,準(zhǔn)確反映病人腫瘤組織病理學(xué)、基因表達(dá)、基因突變,和治療反應(yīng)（4G）.