單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組分析明確了鼻咽癌中腫瘤細(xì)胞、病毒感染和微環(huán)境之間的相互作用

鼻咽癌(NPC)是最常見(jiàn)的頭頸部腫瘤，起源于鼻咽部上皮細(xì)胞，在華南及東南亞地區(qū)高發(fā)。eb病毒(Epstein-Barr virus, EBV)是一種屬于γ-皰疹病毒家族的皰疹病毒，被認(rèn)為是鼻咽癌的致病因子。部分ebv編碼基因參與鼻咽癌的發(fā)生發(fā)展。例如，LMP1可激活宿主NF-κB、PI3K/AKT、ERK/MAPK和JAK/STAT信號(hào)通路，促進(jìn)細(xì)胞增殖和抗凋亡。以往對(duì)鼻咽癌的發(fā)病機(jī)制和分子基礎(chǔ)的研究主要集中在其易感基因、基因組改變和基因表達(dá)模式(在宿主和EBV中)以及宿主病毒相互作用等方面。然而，這些研究很大程度上依賴(lài)于僅從整體角度研究腫瘤的方法，限制了它們?cè)诮馄誓[瘤微環(huán)境(TME)中的亞群事件如瘤內(nèi)異質(zhì)性(ITH)和多細(xì)胞亞型等方面的能力。為了更深入地了解鼻咽癌的多細(xì)胞生態(tài)系統(tǒng)，此篇文獻(xiàn)運(yùn)用scrna測(cè)序技術(shù)(single lecell RNA sequencing, scRNA-seq)，同時(shí)對(duì)鼻咽癌中惡性細(xì)胞、EBV、基質(zhì)細(xì)胞和免疫細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行測(cè)序，并系統(tǒng)地比較腫瘤和非惡性組織的微環(huán)境。

2020年9月，來(lái)自北京大學(xué)生物醫(yī)學(xué)前沿創(chuàng)新中心、生命科學(xué)學(xué)院白凡研究員團(tuán)隊(duì)與中山大學(xué)腫瘤防治中心曾木圣/鐘茜教授團(tuán)隊(duì)合作在Cell Research雜志上發(fā)表了文章“Single-cell transcriptomic analysis defines the interplay between tumor cells, virus infection, and the microenvironment in nasopharyngeal carcinoma”。 

在這項(xiàng)研究工作中，研究人員首先利用Smart-seq2和10x Genomics兩種單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組技術(shù)平臺(tái)對(duì)19個(gè)EBV+ NPC患者的腫瘤樣本（其中3例有配對(duì)轉(zhuǎn)移位組織），以及7例非腫瘤患者的鼻咽組織樣本應(yīng)用scRNA-seq技術(shù)，共捕獲到大約104,000個(gè)單細(xì)胞。經(jīng)過(guò)深入的生物信息學(xué)分析，研究人員在單細(xì)胞水平全面系統(tǒng)的描繪了腫瘤細(xì)胞、EBV、間質(zhì)和免疫細(xì)胞等的轉(zhuǎn)錄組圖譜。同時(shí)，研究人員在單細(xì)胞水平揭示了NPC腫瘤內(nèi)部異質(zhì)性，以及原位和轉(zhuǎn)移位腫瘤組織潛在的播散關(guān)系。對(duì)EBV基因表達(dá)圖譜特征分析表明，EBV潛伏期和裂解期基因可在宿主同一腫瘤細(xì)胞內(nèi)共表達(dá)。

技術(shù)路線(xiàn)：

一、鼻咽癌多細(xì)胞生態(tài)系統(tǒng)的單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組分析

A.展示了使用兩個(gè)平臺(tái)進(jìn)行樣本收集、單細(xì)胞分離、分類(lèi)和scRNA-seq的流程。

b t-SNE圖來(lái)自10個(gè)基因組體的所有單細(xì)胞。

c抗cd3 (T細(xì)胞)、抗cd19 (B細(xì)胞)、抗cd117(肥大細(xì)胞)、抗pan - ck(腫瘤細(xì)胞)、抗cd68(巨噬細(xì)胞)和抗α- sma(成纖維細(xì)胞)抗體的多重免疫組化染色。比例尺，100μm。d t-SNE圖比較來(lái)自腫瘤和非惡性組織的單細(xì)胞分布。

e上圖顯示了基于scRNA-seq數(shù)據(jù)推斷的典型腫瘤(NPC16)中單細(xì)胞CNVs的大尺度變化。下圖顯示了全基因組測(cè)序推斷出的CNVs。

f來(lái)自三種腫瘤的單個(gè)細(xì)胞中顯示ebv衍生測(cè)序的總覆蓋的Circos圖。EBV基因是根據(jù)它們的位置和CDS區(qū)域繪制的。潛在的共表達(dá)基因區(qū)域通過(guò)寬度與單個(gè)細(xì)胞中共表達(dá)事件的數(shù)量成比例的條帶連接。  

二、破譯表達(dá)式程序揭示了惡性細(xì)胞上皮免疫的雙重特征

a使用NMF從代表性腫瘤(NPC16)中破譯出的基因表達(dá)程序的熱圖。

b 50個(gè)腫瘤內(nèi)表達(dá)程序的Pearson相關(guān)性聚類(lèi)。網(wǎng)點(diǎn)大小與相關(guān)系數(shù)的絕對(duì)值成正比。

c鼻咽癌中HLA-DRB1免疫組化染色梯度。Top, HLA-DR在NPC59組織中具有強(qiáng)免疫反應(yīng)性;中等HLA-DR在NPC62組織中的免疫反應(yīng)性;下為HLA-DR在NPC49組織中的弱免疫反應(yīng)性。pan-CK作為鼻咽癌腫瘤細(xì)胞的生物標(biāo)志物，DAPI作細(xì)胞核染色。比例尺，10μm。

d抗hla - dr免疫組化染色。比例尺，100μm。

e HLA-DR高表達(dá)或低表達(dá)患者的總生存期。

f從大量RNA-seq數(shù)據(jù)推斷不同ISs患者的無(wú)進(jìn)展生存期。

g通過(guò)CCK-8試驗(yàn)比較C17鼻咽癌異種移植物的is -高和is -低細(xì)胞存活率。IS-high, EpCAM+HLA-DRhi; IS-low, EpCAM+HLA-DRlow。h, i在注射C17 NPC異種移植瘤的is -高、is -低群體的裸鼠中腫瘤重量和大小的比較。數(shù)據(jù)為SEM的平均值。高,EpCAM + HLA-DRhi;低,EpCAM + HLA-DRlow  

三、鼻咽癌T細(xì)胞聚類(lèi)及狀態(tài)分析

A. 將所有的細(xì)胞分為13組，證實(shí)了T細(xì)胞群的功能異質(zhì)性.

B-C.調(diào)查了13個(gè)集群中典型T細(xì)胞標(biāo)記物的表達(dá)和分布.C4細(xì)胞主要來(lái)源于腫瘤(補(bǔ)充信息，圖S5c)，這表明鼻咽癌的免疫微環(huán)境偏向于更耐受性的環(huán)境。C5細(xì)胞中PDCD1和CXCL13高表達(dá)(圖3b, c)，C4簇代表FOXP3、IL2RA和IKZF2高表達(dá)的調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(treg).。C2、C7和C9的T細(xì)胞顯示NKG7和GZMK等細(xì)胞毒性標(biāo)記物高表達(dá)(圖3c)。
有趣的是，C2、C7和C9的衰竭標(biāo)志物表達(dá)不同

D. 來(lái)自腫瘤和非惡性組織的T細(xì)胞分布呈二分性(圖3d)

E-F.在腫瘤源性CD4+和CD8+ T細(xì)胞中，共刺激和共抑制受體(如TNFRSF9和TIGIT)以及趨化因子受體(如CXCR3和CXCR6)均上調(diào)(圖3e)。比較了腫瘤來(lái)源和非惡性組織來(lái)源的細(xì)胞毒性CD8+ T細(xì)胞、treg細(xì)胞和自然殺傷細(xì)胞(NK)的表達(dá)譜(圖3f)

G.CD8+ T細(xì)胞的發(fā)育軌跡，并根據(jù)典型標(biāo)志物的表達(dá)計(jì)算每個(gè)細(xì)胞的細(xì)胞毒性評(píng)分和衰竭評(píng)分.

H.雖然大多數(shù)CD8+ T細(xì)胞遵循激活耦合衰竭的趨勢(shì)，但仍有一部分細(xì)胞表現(xiàn)出較高的細(xì)胞毒性但較低的衰竭狀態(tài)(圖3h).

I.在CyhighExhigh組中，眾所周知的衰竭標(biāo)志物，如PDCD1、LAG3、TIGIT和HAVCR2顯著上調(diào)。值得注意的是，我們還確定了潛在的新衰竭標(biāo)志物，包括VCAM1、PTMS和TIMD4(圖3i).

四、鼻咽癌中髓細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞聚集及狀態(tài)分析

A. 分析了6053個(gè)髓系細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄組，包括4646個(gè)腫瘤源性細(xì)胞和1407個(gè)非惡性組織源性細(xì)胞。
髓細(xì)胞表現(xiàn)出顯著的異質(zhì)性，分為12組.Cluster C2高表達(dá)IGJ基因，代表pDCs。C8簇由于其FCER1A的高表達(dá)，具有腫瘤特異性，與朗格漢斯細(xì)胞相對(duì)應(yīng)。C9集群專(zhuān)門(mén)表達(dá)CCR7，并代表遷移的DCs.

B. 簇C3、C4、C5和C6代表單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞，如CD14、CD163和CQ1B等基因構(gòu)建了一個(gè)彌散圖來(lái)描繪骨髓細(xì)胞的發(fā)育軌跡.

C. 4個(gè)單核/巨噬細(xì)胞簇中M1和M2信號(hào)呈顯著正相關(guān).

D. 捕獲了1416個(gè)成纖維細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄組，其中1195個(gè)來(lái)源于腫瘤組織，221個(gè)來(lái)源于非惡性組織。利用基于圖的聚類(lèi)，我們鑒定出7個(gè)成纖維細(xì)胞簇。

E. 集群C3和C6顯示ACTA2、MCAM和MYLK的高表達(dá)水平，從而代表肌成纖維細(xì)胞.

F. 纖維細(xì)胞的發(fā)育軌跡顯示肌成纖維細(xì)胞和CAFs譜系不同(圖4f).

G. 鼻咽癌主要細(xì)胞類(lèi)型IFN-α和IFN-γ評(píng)分顯著升高，表明鼻咽癌TME中IFN應(yīng)答整體上調(diào)(圖4g)。   

五、NPC中TME成分和細(xì)胞間相互作用

A. 分析了這些標(biāo)記在RNA-seq中的表達(dá)模式。我們分析了140例初治患者鼻咽癌原發(fā)腫瘤的基因表達(dá)譜，并根據(jù)其TME組成的顯著差異將其分為5組(G1-G5)(圖5a)。G4和G5腫瘤表現(xiàn)出較低的免疫細(xì)胞相關(guān)特征，而G5腫瘤表現(xiàn)出較高的纖維母細(xì)胞相關(guān)特征。G1、G2、G3腫瘤免疫細(xì)胞豐度較高。特別是，G3腫瘤中含有更多的B細(xì)胞，而G2腫瘤中纖維母細(xì)胞的比例明顯更高(圖5a)。

B. 為了驗(yàn)證基于RNA-seq數(shù)據(jù)的TME分層，我們?cè)陬~外的鼻咽癌樣本中對(duì)不同的免疫細(xì)胞和基質(zhì)細(xì)胞進(jìn)行多重免疫組化染色(圖5b)。

C. 檢查了這些患者的臨床記錄，發(fā)現(xiàn)分成5組的患者表現(xiàn)出不同的無(wú)進(jìn)展生存期(PFS)(圖5c)。

D. 大多數(shù)腫瘤細(xì)胞的傳入事件是由成纖維細(xì)胞介導(dǎo)的，因?yàn)槌衫w維細(xì)胞表達(dá)明顯更高數(shù)量的有效配體，其受體被腫瘤細(xì)胞表達(dá)(P < 0.01).

E. 鼻咽癌腫瘤細(xì)胞通過(guò)CXCL10 CXCR3和CXCL16 CXCR6等相互作用對(duì)T細(xì)胞表現(xiàn)出明顯的趨化作用(圖5e).

F. 結(jié)合單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組和大量RNA-seq，我們確定了主要在一種細(xì)胞類(lèi)型中表達(dá)的基因，但與其他細(xì)胞類(lèi)型的豐度相關(guān)。例如，COL6A3、COL14A1和CD248在成纖維細(xì)胞中高表達(dá)，并與TME中EC豐度呈正相關(guān)(圖5f).

G. 與黑色素瘤不同，補(bǔ)體基因如C1S、C3、CFH和CFB也在鼻咽癌腫瘤細(xì)胞中廣泛表達(dá)，并與T細(xì)胞豐度相關(guān).

H. TME中不同細(xì)胞類(lèi)型與非惡性微環(huán)境之間的特異性配體受體相互作用(圖5h).

A.與IS-low水平腫瘤細(xì)胞相比， IS-high水平腫瘤細(xì)胞對(duì)T細(xì)胞表現(xiàn)出更強(qiáng)的配體受體相互作用，如CXCL11 CXCR3、C3 IFITM1、PDL1 PD1，這說(shuō)明IS high水平腫瘤細(xì)胞具有更大的免疫招募、調(diào)節(jié)和抑制潛能(圖6a)。

B. 在其他鼻咽癌組織上使用熒光激活細(xì)胞分選(FACS)，檢測(cè)了TILs上的共抑制受體(如PD-1、lag3、TIM-3、TIM-4和CD276)的表達(dá)，并發(fā)現(xiàn)CD8+ TILs上的表達(dá)與同一鼻咽癌組織中IS-high腫瘤細(xì)胞的豐度呈正相關(guān).

C. 腫瘤的雙重特征與CD8+ T細(xì)胞中共抑制受體的表達(dá)相關(guān)，如TIM-3/PD-1、lag3 /PD-1和CD276/PD-1，反映了CD8+ TILs更深層次的功能障礙(圖6c).

D-E.通過(guò)ELISPOT實(shí)驗(yàn)檢測(cè)TILs與IS-high腫瘤細(xì)胞共培養(yǎng)產(chǎn)生的IFN-γ較少(圖6d, e)。

F.高is腫瘤細(xì)胞具有更強(qiáng)的免疫抑制能力。通過(guò)將腫瘤細(xì)胞與TILs共培養(yǎng)，與is低的腫瘤細(xì)胞相比，is高的腫瘤細(xì)胞誘導(dǎo)具有共抑制受體表達(dá)的CD8+ TILs比例更高(圖6f)