單細(xì)胞測序揭示ETP-ALL共存的致瘤狀態(tài)和免疫逃逸的發(fā)育可塑性

Dana-Farber癌癥研究所Praveen Anand課題組發(fā)現(xiàn)，通過對惡性和微環(huán)境細(xì)胞的全長單細(xì)胞RNA測序，研究了攜帶活化NOTCH1突變的復(fù)發(fā)/難治性早期t細(xì)胞祖細(xì)胞急性淋巴細(xì)胞白血病的耐藥機(jī)制。我們發(fā)現(xiàn)了兩種高度不同的干細(xì)胞樣狀態(tài)，它們在細(xì)胞周期和致癌信號傳導(dǎo)方面存在顯著差異?？焖傺h(huán)的干細(xì)胞樣白血病細(xì)胞表現(xiàn)出Notch激活，通過Notch抑制可有效消除患者體內(nèi)的Notch，而緩慢循環(huán)的干細(xì)胞樣細(xì)胞不依賴于Notch信號通路，而是依賴于PI3K信號通路。該研究還發(fā)現(xiàn)這兩種干細(xì)胞樣狀態(tài)都可以分化為更成熟的白血病狀態(tài)，具有顯著的免疫調(diào)節(jié)功能，包括LGALS9檢查點(diǎn)分子的高表達(dá)。這些細(xì)胞通過表達(dá)LGALS9的同源受體HAVCR2，功能失調(diào)的CD8+ T細(xì)胞克隆積累促進(jìn)免疫抑制白血病生態(tài)系統(tǒng)。研究確定了信號程序、細(xì)胞可塑性和免疫程序之間復(fù)雜的相互作用，這些程序是T-ALL的特征，并說明了腫瘤異質(zhì)性的多維性。相關(guān)論文于2020年11月23日發(fā)表在《Blood》雜志上。

急性T淋巴細(xì)胞白血?。═-ALL）是一種侵襲性的惡性血液腫瘤，主要發(fā)生了兒童和青年人。雖然T-ALL患者的總體預(yù)后較好，但仍有20%左右的患者對常規(guī)治療無應(yīng)答，大部分這類患者都屬于復(fù)發(fā)性或難治性疾病。多種破壞正常胸腺細(xì)胞發(fā)育的細(xì)胞遺傳學(xué)和分子遺傳都可導(dǎo)致T-ALL，大部分病例可根據(jù)胸腺細(xì)胞不同的成熟狀態(tài)劃分亞組。

早期急性T前體淋巴細(xì)胞白血?。‥TP-ALL）是一種特殊的T-ALL亞型，顯示出獨(dú)特的遺傳和轉(zhuǎn)錄特征，表明它們與髓系前體細(xì)胞和髓系惡性腫瘤有密切的關(guān)系。目前還不清楚這些特征是否同時存在于單個ETP-ALL細(xì)胞中，是否能夠反映腫瘤細(xì)胞群中離散的、異質(zhì)的細(xì)胞狀態(tài)。 

樣本信息：

收集NCT01363817試驗(yàn)（應(yīng)用了Notch抑制劑BMS-906024）招募的攜帶NOTCH1激活突變的復(fù)發(fā)性/難治性ETP-ALL患者的血液或骨髓樣本。建立了T-ALL的移植瘤動物模型（PDX），采用了多種腫瘤細(xì)胞系：DND-41、KOPT-K1、HPB-ALL、Loucy、MOLT-4、NALM-6、SEM、KG-1、Jurkat 和HL-60。

技術(shù)路線： 

一、難治性ETP-ALL細(xì)胞表達(dá)與正常淋巴細(xì)胞和造血祖細(xì)胞相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子

A-D通過進(jìn)行PAGODA2聚類和t隨機(jī)鄰居嵌入(t-SNE)可視化，發(fā)現(xiàn)13個不同的細(xì)胞簇(圖1B, C)。5個簇(簇1，簇7，簇8，簇10和簇11)在不同的患者和正常供者之間是常見的，而其余的大多數(shù)簇是針對個別患者特異性的，顯示出高度的內(nèi)相關(guān)性(圖1A, C, D)。

由于clusters 2、3、4、5、6和13是患者特有的，在正常供體中看不到(圖1B、C)，假設(shè)這些是惡性細(xì)胞，因?yàn)榛颊咛禺愋缘膼盒约?xì)胞聚集是典型的單細(xì)胞分析，可能是因?yàn)榇嬖谔囟ㄓ趩蝹€腫瘤的遺傳/表觀遺傳改變。使用互補(bǔ)的方法來明確區(qū)分惡性和非惡性免疫細(xì)胞(t細(xì)胞、b細(xì)胞和單核細(xì)胞)(圖1F)。SNVs和CNVs與臨床測序結(jié)果一致，僅在假定的惡性細(xì)胞群中檢測到，值得注意的是，沒有檢測到等位基因頻率為40%的SNVs和低水平表達(dá)的基因中的SNVs，可能是由于退出事件。

二、ETP-ALL表現(xiàn)出錯亂的發(fā)育層次，譜系承諾無效，同時存在莖樣狀態(tài)

為了進(jìn)一步探索單個細(xì)胞內(nèi)的譜系失真，尋找表達(dá)HSC(造血干細(xì)胞),MPP(多能祖),CMP(常見的髓系祖)、GMP (granulocyte-monocyte祖)和CLP(常見的淋巴祖)早期家族signatures,按照BLUEPRINT consortium,以及胸腺前體signatures(ETP, DN1, DN2、DN3 DN4和DP), ImmGen定義的研究。大多數(shù)白血病細(xì)胞表現(xiàn)出高表達(dá)的DN1 signatures，與他們的臨床注釋ETP-ALL一致.

盡管干細(xì)胞和譜系標(biāo)記物在幾乎所有被研究的細(xì)胞中都有共表達(dá)，但仍可能有一種細(xì)胞亞群具有更強(qiáng)的干細(xì)胞樣特征。為此，我們首先使用t-SNE根據(jù)與造血干細(xì)胞和祖細(xì)胞程序相關(guān)的基因表達(dá)對所有白血病細(xì)胞進(jìn)行聚類。

然后，我們利用RNA速度，基于未剪接/剪接轉(zhuǎn)錄本的水平，沿著成熟軌跡識別細(xì)胞。t-SNE維度上的速度投影顯示了兩種不成熟的根狀態(tài)和一種單一的端點(diǎn)狀態(tài)(圖2C)。這些狀態(tài)分為不同的無監(jiān)督集群，由來自所有患者的細(xì)胞組成，表明它們是由獨(dú)立的轉(zhuǎn)錄回路控制的。

E.兩種root states 都富含與造血干細(xì)胞相關(guān)的基因，如CD34, CD44, NCAM1, BCL11A和GATA2. 相反，終點(diǎn)狀態(tài)的特征是與t細(xì)胞分化相關(guān)的基因的表達(dá)，如IL7R, LCK, BCL11B和CD387，通常在 stem-like root 細(xì)胞中低水平表達(dá).終點(diǎn)細(xì)胞也表現(xiàn)出強(qiáng)烈的免疫調(diào)節(jié)信號富集，表現(xiàn)為IRF1、IFITM3和IFI44L的表達(dá).

細(xì)胞周期分析表明，root 1細(xì)胞不循環(huán)，而root 2細(xì)胞富集于S期細(xì)胞(圖2F, S14)。如果這些根狀態(tài)反映了不同的類莖狀態(tài)，那么應(yīng)該有不同的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子驅(qū)動著每個狀態(tài)。因此，我們利用SCENIC24識別出這兩種根狀態(tài)中最顯著的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子(轉(zhuǎn)錄因子及其靶基因)

所有這些ETP-ALL模型也顯示了在同一細(xì)胞中多個前體信號和更成熟的胸腺細(xì)胞信號的共表達(dá)，不依賴于Notch突變狀態(tài)(圖2H).

雖然成熟T-ALL細(xì)胞也同時表現(xiàn)出HSC和CLP signatures，同時表現(xiàn)出更成熟的胸腺signatures，但髓系程序(GMP, CMP)的激活比ETP-ALL PDX模型中少見(圖2I)。

三、干細(xì)胞樣狀態(tài)的特征是通過Notch或PI3K來反對致癌信號

假設(shè)莖狀種群的持久性存在可能是Notch抑制劑對復(fù)發(fā)/難治性切口突變T-ALL患者療效有限的原因。事實(shí)上，Notch抑制消除了循環(huán)的莖樣根細(xì)胞(root 2)，而非循環(huán)的根細(xì)胞(root 1)在Notch抑制劑處理后仍然存在(圖3A)。

該分析表明，PI3K激活是Notch信號通路中最抗相關(guān)的通路，PI3K激活在非循環(huán)根細(xì)胞中強(qiáng)烈富集，而在循環(huán)根細(xì)胞中幾乎不存在.

有趣的是，PI3K信號活性高而Notch信號活性低的細(xì)胞已經(jīng)在預(yù)處理前出現(xiàn)(圖3C)， PI3K活性隨著處理的增加而增加，而Notch活性則下降(圖3D, E, F, S14;表S14).

G.進(jìn)一步分析這些亞群的轉(zhuǎn)錄動力學(xué)發(fā)現(xiàn)，在未經(jīng)處理的細(xì)胞中有兩種狀態(tài)，具有較高的Notch活性或較高的PI3K活性，通過RNA速度，拮抗分化軌跡均指向與中間PI3K和Notch活性共享的狀態(tài)(圖3G)。

H-I. 莖樣根細(xì)胞分為Notchactive和PI3K活性群(圖3H，相關(guān)系數(shù)R = -0.7, p = 2.2e-16)，而端點(diǎn)態(tài)細(xì)胞在界面處富集，而Notch與PI3K活性無相關(guān)性(圖3I, R = -0.28, p = 1.2e-07)。

J. 在治療過程中，PI3K活性較高的亞簇占優(yōu)勢，但它們向界面中間端點(diǎn)狀態(tài)的分化軌跡沒有任何變化(圖3J)。

到目前為止，分析主要集中在具有NOTCH1突變的復(fù)發(fā)/難治性ETP-ALL患者，接下來，我們研究是否可以在PDX模型中檢測到分化的Notch和PI3K狀態(tài)，該模型是在治療前的診斷時獲得的樣本建立的。

A.在7個ETP-ALL PDXs和5個成熟T-ALL PDXs中(見表2)，具有高Notch表達(dá)特征的細(xì)胞PI3K激活特征較低，反之亦然。

B-C.在兩種根狀態(tài)下，我們發(fā)現(xiàn)Notch信號和PI3K信號的激活信號存在差異，低循環(huán)狀態(tài)的根細(xì)胞表達(dá)高PI3K激活信號，高循環(huán)狀態(tài)的根細(xì)胞表達(dá)更高的Notch激活信號。這些發(fā)現(xiàn)獨(dú)立于NOTCH1突變或PTEN缺失的存在，這與作為這些細(xì)胞狀態(tài)基礎(chǔ)的轉(zhuǎn)錄重組是一致的.

D. 結(jié)合靶向Notch和PI3K信號通路可能同時靶向干細(xì)胞樣狀態(tài)。為了驗(yàn)證這一假設(shè)，我們首先在體外證實(shí)了Notch抑制(GSI)和PI3K抑制(Buparlisib)聯(lián)合在T-ALL細(xì)胞系中的協(xié)同效應(yīng)(圖4D, S19A-C)。

E. 我們推斷這一群體可能反映了先前存在的PI3K依賴性細(xì)胞。使用單細(xì)胞克隆，我們確認(rèn)了已經(jīng)存在的gsi耐受細(xì)胞群體(圖4E)。這些細(xì)胞高度依賴PI3K信號通路，在GSI存在下單細(xì)胞克隆之前，通過Buparlisib預(yù)處理幾乎完全消除了這些細(xì)胞(圖4E).

F.在未處理的KOPT-K1細(xì)胞中檢測到一小群CD34+細(xì)胞(圖4F, S19D)，約20%的細(xì)胞通過磷酸化流分析顯示PI3K激活，而CD34- KOPT-K1細(xì)胞這些標(biāo)記物呈陰性。此外，當(dāng)GSI處理KOPT-K1細(xì)胞時，該群體擴(kuò)大，而PI3K抑制具有相反的作用(圖4F). 

四、白血病微環(huán)境中Galectin-9的HAVCR2相互作用導(dǎo)致的免疫逃避

ETP-ALL是否與免疫微環(huán)境中t細(xì)胞功能的改變有關(guān)。值得注意的是，與正常供體t細(xì)胞相比，白血病患者中內(nèi)源性t細(xì)胞的t細(xì)胞受體(TCR)庫偏向于使用 oligoclonal TCR(圖5A)。

D.為了確定CD8+ t細(xì)胞分化狀態(tài)，我們使用monocle 2進(jìn)行了非監(jiān)督偽時間分析，并確定了六種t細(xì)胞狀態(tài)沿著共同的軌跡發(fā)展(圖5B)。狀態(tài)1主要由來自正常供者的CD8+ t細(xì)胞組成，這些細(xì)胞表達(dá)幼稚CD8+ t細(xì)胞的標(biāo)志物(CCR7, IL7R, NELL2, SELL, TCF7)(圖5C, D).

相比之下，狀態(tài)5和狀態(tài)6主要包含患者CD8+ t細(xì)胞，CD8+ t細(xì)胞表現(xiàn)出t細(xì)胞耗竭標(biāo)志物(PDCD1、TIGIT、LAG3、HAVCR2、CD244)的表達(dá)增加，提示這些細(xì)胞存在功能障礙(圖5D)。RNA速度分析證實(shí)了從狀態(tài)5向功能更失調(diào)狀態(tài)6的分化方向(圖5E)。

為了確定衰竭的程度，我們分析了所有CD8+ t細(xì)胞的衰竭評分。高衰竭評分主要出現(xiàn)在ETP-ALL患者使用寡克隆TCR的細(xì)胞中，而高衰竭評分的CD8+ t細(xì)胞在正常供者中則不常見(圖5F)。

B.為了確定哪些配體和受體可能與ETP-ALL中的t細(xì)胞功能障礙相關(guān)，我們測定了它們的表達(dá)水平，并計(jì)算了白血病細(xì)胞中CD8+ t細(xì)胞表達(dá)的抑制性受體及其各自配體之間的相互作用scores70(圖6A, B)。發(fā)現(xiàn)HAVCR2 (TIM-3)及其配體LGALS9 (Galectin-9)的相互作用得分最強(qiáng)，LGALS9在所有白血病細(xì)胞中普遍表達(dá)(圖6B, S20A)。

C.ETP-ALL患者骨髓活檢免疫組化(IHC)染色證實(shí)白血病原細(xì)胞上LGALS9表達(dá)，散在單核細(xì)胞上HAVCR2表達(dá)(圖6C)。

D. 為了檢驗(yàn)T-ALL細(xì)胞是否會引起t細(xì)胞功能障礙，我們首先通過流式細(xì)胞術(shù)證實(shí)了LGALS9蛋白在T-ALL細(xì)胞系中的表達(dá)(圖6D, S21).

E. 然后，我們將來自正常供者的活化的CD8+ t細(xì)胞(含和不含T-ALL上清液(含LGALS9))培養(yǎng)三天。暴露于T-ALL上清液的CD8+ t細(xì)胞顯示出主要的CD8+ t細(xì)胞效應(yīng)分子GZMB (granzyme B)的下調(diào)，衰竭標(biāo)志物HAVCR2和TIGIT的上調(diào)(圖6E)，而這一作用被一種中和性抗lgals9抗體所消除(圖S22)。

【總結(jié)】

該研究明確了可表征T-ALL的信號程序、細(xì)胞可塑性和免疫程序之間復(fù)雜的相互作用，并闡明了腫瘤異質(zhì)性的多維性。在這種情況下，針對不同致癌狀態(tài)和免疫生態(tài)系統(tǒng)的聯(lián)合治療似乎最有希望通過共存的轉(zhuǎn)錄程序成功消除免疫逃逸的腫瘤細(xì)胞。