NLRP3上調(diào)PD-L1參與淋巴瘤的免疫抑制

研究背景：腫瘤微環(huán)境(TME)中的慢性炎癥使惡性細(xì)胞逃避宿主免疫監(jiān)測，從而促進(jìn)了腫瘤的發(fā)生。炎性小體在惡性細(xì)胞與TME的相互作用中發(fā)揮重要作用。NLRP3炎性小體在多種惡性腫瘤中起促瘤作用。然而，它在淋巴發(fā)育中的潛在作用尚不清楚。Fei Lu等人在Cancer Lett（IF= 7.36）這一雜志中發(fā)表文章研究NLRP3咋淋巴瘤中的預(yù)后作用及作用機(jī)制。

技術(shù)路線圖：

研究結(jié)果：

1.淋巴瘤患者IL-18的水平升高，并且與腫瘤微環(huán)境中PD-L1的水平相關(guān)

應(yīng)用微陣列分析了淋巴瘤腫瘤（DLBCL）和正常淋巴組織中效應(yīng)細(xì)胞因子的水平，來評估NLRP3炎癥小體在淋巴瘤微環(huán)境中的作用。在DLBCL中,IL-18水平升高（圖1A）。具有非生發(fā)中心B細(xì)胞的患者中IL-18的水平更高（圖1B）。如圖1C，在CD10+和MUM1-患者中，IL-18和IL-1β的表達(dá)較低。而且，DLBCL組織中，PD-L1的表達(dá)更高（圖1D），暗示患者不良預(yù)后。TME中PD-L1的表達(dá)與IL-18水平呈正相關(guān)(圖1F)，這可能歸因于NLRP3炎癥小體的激活。圖1G, OCI-LY3, RC和DB（淋巴瘤細(xì)胞系）中NLRP3炎癥小體激活。NLRP3 抑制劑MCC950降低IL-1β和抑制PD-L1的表達(dá)。人DLBCL細(xì)胞系中NLRP3炎癥小體激活，與PD-L1的表達(dá)相關(guān)，我們假設(shè)在惡性細(xì)胞和細(xì)胞毒性T細(xì)胞之間的相互作用中，NLRP3炎癥小體的激活影響免疫反應(yīng)。炎癥小體NLRP3的激活減少CD8+T細(xì)胞的比例，而抑制劑降低這種作用（圖1H）。表明NLRP3的激活在體外上調(diào)了B細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞的PD-L1水平，降低了細(xì)胞毒性T細(xì)胞，特別是在與免疫細(xì)胞長期相互作用后。

Fig.1

2.DLBCL病人中免疫抑制細(xì)胞增加

圖2A所示，在DLBCL中，PD-1+，TIM-3+ T細(xì)胞水平顯著升高。DLBCL病人患病嚴(yán)重時(shí)，T細(xì)胞中PD-1和TIM-3的水平較高（圖2B）。高PD-1+細(xì)胞與血清中LDH的水平相關(guān)。然而，高表達(dá)PD-1+， TIM-3+ T細(xì)胞與DLBCL患者不良預(yù)后有關(guān)。DLBCL患者中循環(huán)MDSC和Tregs細(xì)胞增加。結(jié)果說明，DLBCL患者中的免疫抑制狀態(tài)，表現(xiàn)為腫瘤中PD-L1高表達(dá)，PD-1+/TIM-3+ T細(xì)胞，MDSC和Tregs細(xì)胞增加。

Fig.2

3. NLRP3炎性小體阻斷抑制淋巴瘤生長并減少PD-L1表達(dá)

在皮下注射同基因A20淋巴瘤細(xì)胞的小鼠中觀察NLRP3炎性小體在B細(xì)胞淋巴瘤進(jìn)展中的作用，腫瘤組織勻漿中，IL-18和IL-1β的水平升高（圖3B）。MCC950顯著減少了淋巴瘤的生長和抑制腫瘤發(fā)展（圖3C-E）。MCC950降低了腫瘤組織和脾臟中活性caspase-1，活性IL-1β和IL-18的水平（圖3F-G）。另外，MCC950抑制腫瘤中PD-L1的表達(dá)（圖3F）。MCC950還降低了腫瘤中磷酸化的STAT3 (pSTAT3)水平，這表明阻斷NLRP3炎癥小體抑制STAT3激活，可能與PD-L1下調(diào)有關(guān)（圖3F）。

Fig.3

4.NLRP3炎癥小體阻斷減少免疫抑制細(xì)胞的群體

PD-L1和 PD-1的相互作用是腫瘤免疫逃逸的關(guān)鍵。文章分析了荷瘤小鼠中不同免疫細(xì)胞群的比例，MCC950處理顯著增加了腫瘤浸潤性CD8+ T細(xì)胞和脾T細(xì)胞的比例(圖4A)，以及TNF引起的CD3+和CD4+ T細(xì)胞的比例(圖4B)。MCC950處理導(dǎo)致小鼠脾臟IFN誘導(dǎo)的CD3+和CD4+ T細(xì)胞顯著減少(圖4B);這可能是導(dǎo)致PD-L1下調(diào)的部分原因。此外，MCC950顯著降低了脾臟和淋巴結(jié)中CD3+和CD4+ T細(xì)胞中PD-1的表達(dá)(圖4C)。此外,MCC950治療也減少了脾T細(xì)胞和CD4 + T淋巴細(xì)胞中TIM-3 (圖未展示),MDSCs，TAM表達(dá)(圖4 D和E),和Tregs在腫瘤組織和脾臟中的表達(dá)(圖4F)。這些發(fā)現(xiàn)表明NLRP3炎癥小體激活和免疫抑制之間有很強(qiáng)的相關(guān)性，并證明NLRP3炎癥小體的阻斷可以延緩淋巴瘤的進(jìn)展。

Fig.4

5.體內(nèi)阻斷IL-18減少免疫抑制細(xì)胞的比例

進(jìn)一步研究NLRP介導(dǎo)免疫抑制的機(jī)制。使用IL-1β和IL-18的中和抗體，腫瘤負(fù)擔(dān)減輕(圖5A)。IL-18的中和抗體處理的小鼠腫瘤浸潤CD8+ T細(xì)胞和淋巴及循環(huán)CD8+ T細(xì)胞的百分比明顯升高(圖5B)。IL-1β的中和抗體僅提高了淋巴結(jié)中CD8+ T細(xì)胞的比例 (圖5B)。

而且，在淋巴瘤小鼠中抑制IL-18導(dǎo)致淋巴結(jié)中PD-1+ CD3+ 和PD-1+ CD8+細(xì)胞的水平降低，以及外周血，脾臟，和腫瘤中PD-1 + CD4 +細(xì)胞比例減少。而IL- 1β抑制并不影響T細(xì)胞中PD-1表達(dá)(圖5C)?？?/span>IL -18抗體也下調(diào)了腫瘤浸潤T細(xì)胞中TIM-3的表達(dá)，而抗IL-1β抗體增強(qiáng)了腫瘤T細(xì)胞中TIM-3的表達(dá)(圖5D)。此外，抗IL -18和抗IL-1β抗體處理的淋巴瘤小鼠外周血中MDSCs和TAMs顯著降低(圖5E)。此外，IL-18中和作用降低了腫瘤和脾臟中treg的比例(圖5F)。與mcc950處理小鼠的數(shù)據(jù)一致，接受IL-1β蛋白和IL -18處理的荷瘤小鼠腫瘤組織中PD-L1水平下調(diào)，pSTAT3水平降低(圖5G)。綜上所述，NLRP3炎性小體阻斷可通過降低效應(yīng)細(xì)胞因子IL-18介導(dǎo)的免疫抑制而至少部分地改善淋巴瘤進(jìn)展。

Fig.5

6. NLRP3炎性小體阻斷聯(lián)合抗PD-L1治療具有拮抗作用

使用MCC950或抗PD-L1抗體治療的小鼠腫瘤負(fù)荷顯著降低;然而，聯(lián)合治療降低了單獨(dú)使用對腫瘤的抑制效果(圖6B)?？?/span>PD-L1治療恢復(fù)了荷瘤小鼠的T細(xì)胞活性，表現(xiàn)為腫瘤浸潤T細(xì)胞，特別是CD8+ T細(xì)胞數(shù)量的增加 (圖6C)。雖然PD-L1阻斷后脾臟T細(xì)胞的比例沒有變化(圖6C)，但脾臟中IFN-誘導(dǎo)的CD8+ T細(xì)胞和TNF誘導(dǎo)的T細(xì)胞比例顯著增加(圖6D)。聯(lián)合治療組腫瘤浸潤CD8+ T細(xì)胞比例明顯低于抗PD-L1單藥治療組(圖6C)。聯(lián)合治療組脾臟CD3+、CD4+和CD8+ T細(xì)胞產(chǎn)生的IFN和TNF的水平也降低(圖6D)。因此，NLRP3炎性小體的抑制可能破壞PD-L1阻斷所導(dǎo)致的T細(xì)胞功能增強(qiáng)。PD-L1阻斷后脾臟和淋巴T細(xì)胞上的PD-1水平顯著升高(圖6E)。此外，聯(lián)合治療組脾臟和淋巴T細(xì)胞上的PD-1和TIM-3表達(dá)均明顯高于MCC950單藥治療組(圖6E)。此外， PD-L1阻斷和聯(lián)合治療均顯著增加了腫瘤浸潤性MDSCs(圖6F)和TAMs(圖6G)，但不影響腫瘤浸潤性treg的比例(圖6H)。因此PD-L1阻斷部分抑制了MCC950在TME中的免疫刺激功能。

Fig.6