CCL7是非小細(xì)胞肺癌免疫療法的潛在生物標(biāo)志物和佐劑

肺癌是最普遍的癌癥，也是與癌癥相關(guān)的死亡的主要原因，每年在全球造成200萬以上的新診斷和170萬死亡。大約85%的肺癌診斷為非小細(xì)胞肺癌（NSCLC），其中50％以上的腺癌和30%的鱗狀癌。由于非典型癥狀，約三分之二的NSCLC患者在診斷時出現(xiàn)晚期疾病。已鑒定出NSCLC腫瘤中的許多體細(xì)胞突變，致癌性重排或拷貝數(shù)變異，包括EGFR基因19號外顯子的缺失，L858R或T790M突變，MET基因14號外顯子的跳躍突變，ALK或ROS1重排，MET，EGFR或HER2的拷貝數(shù)增加。各種小分子抑制劑和單克隆抗體已經(jīng)被開發(fā)靶向這些基因改變和顯著改善NSCLC患者的預(yù)后。盡管取得了這些進(jìn)展，但目前尚無針對KRAS突變的NSCLC患者的具體治療策略，KRAS突變是10-20%的NSCLC患者中最常見的致癌驅(qū)動因素。此外，已在KRAS突變的NSCLC中鑒定出常見的共突變伴侶，包括TP53，LKB1和CDKN2A。這些共突變因子提供了不同的基因表達(dá)譜，并可能確定針對KRAS突變的NSCLC的不同治療策略。近期，武漢大學(xué)鐘波教授，林丹丹教授及華中科技大學(xué)褚倩教授發(fā)現(xiàn)CCL7通過募集常規(guī)DC1（cDC1）促進(jìn)Kras^LSL-G12D/+Tp53^fl/fl（KP）和Kras^LSL-G12D/+Lkb1^fl/fl（KL）NSCLC小鼠模型的抗PD-1治療，促進(jìn)T細(xì)胞擴(kuò)增，相關(guān)研究以“CCL7 recruits cDC1 to promote antitumor immunity and facilitate checkpoint immunotherapy to non-small cell lung cancer”為題發(fā)表在Nature communications上，雜志影響因子12.121。

技術(shù)路線：

結(jié)果：

1、  CCL7在NSCLC腫瘤組織中高表達(dá)

作者從楔形切除或肺葉切除的18名NSCLC患者中收集了腫瘤和正常肺組織，并通過實時熒光定量PCR（qRT-PCR）分析了CCL7的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)腫瘤組織中CCL7的mRNA水平明顯高于正常組織（圖a）。隨后，作者從NSCLC患者中收集了另一組共44對的腫瘤和正常肺組織，發(fā)現(xiàn)CCL7在腫瘤組織中高表達(dá)（圖b），且免疫組織化學(xué)和集成光密度分析的結(jié)果證實腫瘤組織中CCL7的蛋白水平高于正常肺組織（圖c）。此外，高CCL7蛋白水平與NSCLC患者的總生存（OS）有顯著正相關(guān)（圖d）。以上數(shù)據(jù)表明，CCL7在NSCLC腫瘤組織中上調(diào)，并與NSCLC患者的OS正相關(guān)。接下來，作者在獲得的KP（Kras^LSL-G12D/+小鼠和Tp53^fl/fl小鼠雜交）/KP7小鼠（Ccl7^-/-小鼠與KP小鼠雜交）中鼻內(nèi)注射Ad-Cre病毒，十周后進(jìn)行流式細(xì)胞儀分析發(fā)現(xiàn)CCL7^IRES?ZsGreen在CD11c⁺CD11b^?H-2K^b?CD103^?肺泡巨噬細(xì)胞（AM）中表達(dá)，但在CD11c⁺CD11b^?H-2K^b+CD103⁺樹突細(xì)胞（DCs）、CD11b⁺CD11c^?細(xì)胞、CD19⁺ B細(xì)胞、CD4⁺或CD8⁺ T細(xì)胞中不表達(dá)（圖e-g），且CCL7^IRES?ZsGreen在CD45.2^?CD31⁺CD81^?CD49d^?內(nèi)皮細(xì)胞、CD45.2^?CD31^?CD81⁺CD49d^?成纖維細(xì)胞以及CD45.2^?CD31^?CD81^?CD49d^?腫瘤細(xì)胞中被發(fā)現(xiàn)，而在CD45.2^?CD31⁺CD49d⁺基質(zhì)細(xì)胞中沒有表達(dá)。這些數(shù)據(jù)說明腫瘤誘導(dǎo)后KP小鼠肺部多種細(xì)胞中的CCL7被上調(diào)。

2、  CCL7缺失促進(jìn)KP小鼠模型的腫瘤發(fā)生

作者通過鼻內(nèi)注射Ad-Cre病毒誘導(dǎo)KP/KP7小鼠肺腫瘤發(fā)生，KP7小鼠的中位OS為82天，而KP小鼠的中位OS則明顯更長（105天）（圖a，b）。組織學(xué)分析表明誘導(dǎo)腫瘤后6-10周，KP小鼠或KP7小鼠肺部的腫瘤數(shù)量相當(dāng)（圖c，d）。此外，誘導(dǎo)后第6周的KP小鼠和KP7小鼠的腫瘤大小和面積相當(dāng)，而誘導(dǎo)后第8或10周的KP7小鼠肺部的腫瘤大小和面積明顯更大（圖 2e，f），表明CCL7缺失在早期不影響NSCLC腫瘤的發(fā)生，但是在晚期抑制腫瘤的進(jìn)展。這些數(shù)據(jù)說明在KP小鼠模型中CCL7在NSCLC發(fā)育中的抑制作用。

3、  CCL7缺失會削弱cDC1向荷瘤肺的浸潤

作者制備了來自誘導(dǎo)后10周的KP小鼠和KP7小鼠的腫瘤負(fù)擔(dān)的肺的單細(xì)胞懸液，并用各種單核細(xì)胞標(biāo)記物染色，然后進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)分析，發(fā)現(xiàn)KP7小鼠肺的總細(xì)胞數(shù)多于KP小鼠，可能是由于KP7小鼠的腫瘤大小大于KP小鼠（圖a，b），且KP7小鼠肺中CD11c⁺CD11b^-細(xì)胞的百分比和細(xì)胞數(shù)量比KP小鼠顯著減少（c）。作者進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，與KP小鼠相比，KP7小鼠荷瘤肺中表達(dá)高水平的CD86、XCR1和CD24以及低水平的CD64的CD11c⁺CD11b^?CD103⁺H2K^b+ DCs數(shù)量顯著減少（圖d，e）。這些數(shù)據(jù)表明CCL7主要吸引KP小鼠模型中荷瘤肺中的cDC1。在此背景下，作者發(fā)現(xiàn)與CD11c⁺CD11b^?CD103^?H-2K^b?肺泡巨噬細(xì)胞或CD11c^?CD11b⁺ 細(xì)胞相比，CCL7受體CCR1、CCR2和CCR3在cDC1上高表達(dá)（圖d）。然而有趣的是，KP小鼠或KP7小鼠肺中CD11c⁺CD11b^?細(xì)胞上CD103，H-2K^b的百分比相當(dāng)，來自KP小鼠或KP7小鼠肺的cDC1表達(dá)相當(dāng)?shù)?/span>CD86、XCR1、CD24或CCL7受體，表明CCL7缺失不影響cDC1的活化或分化或活化cDC1上CCL7受體的表達(dá)，而在腫瘤誘導(dǎo)后10周，與KP小鼠相比，KP7小鼠肺腫瘤中cDC1的數(shù)量顯著減少，CD11c、CD103和XCR1的強(qiáng)度顯著降低(圖d-f)。這些數(shù)據(jù)表明CCL7是cDC1最佳浸潤到荷瘤肺所必需的，但不是浸潤cDC1活化所必需的。

4、  CCL7缺失會削弱抗腫瘤免疫反應(yīng)的激活

作者分析了支氣管引流淋巴結(jié)（dLNs）中的適應(yīng)性免疫反應(yīng)，發(fā)現(xiàn)來自KP7小鼠的支氣管dLNs的總細(xì)胞數(shù)明顯少于來自KP小鼠的支氣管dLNs（圖a）, 盡管在腫瘤誘導(dǎo)后10周，KP小鼠和KP7小鼠支氣管dLN中CD8⁺ T細(xì)胞的百分比相當(dāng)， 而與KP小鼠對比，CD8⁺IFNγ⁺ T細(xì)胞的數(shù)量顯著減少，表明在KP小鼠模型中腫瘤誘導(dǎo)后CCL7缺失損害支氣管dLN中CD8⁺ T細(xì)胞擴(kuò)增(圖b)。接著，作者通過Percoll介導(dǎo)的梯度離心從KP小鼠和KP7小鼠的荷瘤肺中分離出肺浸潤淋巴細(xì)胞（LIL），利用各種淋巴細(xì)胞標(biāo)記物進(jìn)行染色，流式分析發(fā)現(xiàn)與誘導(dǎo)腫瘤后10周的KP小鼠肺相比，KP7小鼠肺中LILs的總細(xì)胞數(shù)明顯減少（圖c）。與KP小鼠相比，KP7小鼠LILs中CD8⁺ 或CD8⁺IFNγ⁺ T細(xì)胞數(shù)量顯著降低（圖d，e）。總的來說，這些數(shù)據(jù)表明CCL7缺失損害了KP小鼠模型支氣管dLN和荷瘤肺中T細(xì)胞的擴(kuò)增和聚集。

5、  CD11c⁺ DC的消耗可促進(jìn)KP小鼠模型中NSCLC的發(fā)育

作者將CD11c^-白喉毒素受體（DTR）骨髓細(xì)胞轉(zhuǎn)移到經(jīng)輻照的KP小鼠或KP7小鼠體內(nèi)，然后進(jìn)行腫瘤誘導(dǎo)和DT介導(dǎo)的CD11c⁺細(xì)胞耗竭（圖a）。通過DT處理，有效的消除了KP小鼠或KP7小鼠肺中的CD11c⁺或CD11c⁺CD103⁺H-2K^b+ DC（圖b）。在KP小鼠和KP7小鼠中，CD11c⁺ DCs的耗竭顯著促進(jìn)NSCLC的發(fā)展， DT處理的KP小鼠和KP7小鼠的荷瘤肺和生長相當(dāng)（圖c，d）, 表明在KP小鼠模型中CCL7介導(dǎo)的CD11c⁺ DCs募集在抑制腫瘤發(fā)生中的重要作用。與此一致，DT處理后，KP小鼠或KP7小鼠支氣管dLN和LILs中的CD8⁺IFNγ⁺ T細(xì)胞以及腫瘤中CD8、XCR1和CD11c染色的強(qiáng)度顯著降低（圖e-g）。

6、  在KP小鼠模型中，肺中給予CCL7可抑制NSCLC

作者對KP小鼠和KP7小鼠鼻內(nèi)注射Ad-Cre病毒，6周后分別向這些小鼠鼻內(nèi)注射Lenti-Vec或Lenti-CCL7，免疫組化分析證實了在注射Lenti-CCL7的KP小鼠或KP7小鼠的肺中CCL7的表達(dá)，與相應(yīng)的對照組相比，注射CCL7可以顯著延長KP小鼠或KP7小鼠的生存期并抑制其腫瘤發(fā)展（圖a-e）。同時發(fā)現(xiàn)，與注射對照病毒的小鼠相比，注射了CCL7的KP小鼠或KP7小鼠的腫瘤肺中浸潤性cDC1的數(shù)量以及CD11c，XCR1和CD8染色的強(qiáng)度顯著增加（圖f，g）。這些數(shù)據(jù)表明CCL7在KP小鼠模型中充當(dāng)NSCLC的治療劑。

7、  CCL7增強(qiáng)抗PD-1檢查點免疫療法的功效

作者在有或沒有腹膜內(nèi)注射抗PD-1的情況下，每周兩次向KP小鼠鼻內(nèi)注射Ad-Cre，然后進(jìn)行Lenti-Vec或Lenti-CCL7注射，持續(xù)4周，發(fā)現(xiàn)抗PD-1治療顯著延長了KP小鼠的存活，與注射空載體相比，通過注射CCL7進(jìn)一步延長了存活，且抗PD-1治療顯著抑制了KP小鼠的腫瘤發(fā)展，與空載體相比，聯(lián)合注射CCL7進(jìn)一步抑制了其發(fā)展（圖a-c）。此外，與單獨使用抗PD-1治療相比，CCL7和抗PD-1的聯(lián)合治療顯著增加了KP小鼠肺中CD11c⁺或XCR1⁺ DC和CD8⁺ T細(xì)胞的浸潤(圖d-e)。

接著，作者檢查了CCL7是否可以在KL小鼠模型中促進(jìn)抗腫瘤免疫，通過KL小鼠經(jīng)鼻內(nèi)注射Ad-Cre，5周后感染Lenti-Vec或Lenti-CCL7，然后進(jìn)行分析或存活觀察，發(fā)現(xiàn)CCL7顯著延長了KL小鼠的存活，并抑制了KL小鼠中的NSCLC發(fā)育，且增加了KL小鼠腫瘤中CD11c，XCR1和CD8的染色（圖a-c）。同時發(fā)現(xiàn)抗PD-1治療沒有明顯改善KL小鼠的存活，而與單獨使用抗PD-1治療相比，CCL7和抗PD-1的組合顯著延長了KL小鼠的存活(圖d)。作者回顧了接受帕博利珠單抗或信迪利單抗治療的晚期NSCLC患者CT引導(dǎo)下穿刺活檢中CCL7的水平和抗PD-1免疫治療的療效，結(jié)果表明，部分緩解或疾病穩(wěn)定患者活檢組織中CCL7和CD11c+和CD8+細(xì)胞的染色顯著高于疾病進(jìn)展患者（圖f，e），表明CCL7可作為NSCLC檢查點免疫治療的預(yù)后或診斷標(biāo)志物。

結(jié)論：

1.      CCL7在NSCLC腫瘤組織中表現(xiàn)出高表達(dá)，并且與腫瘤微環(huán)境（TME）中cDC1的浸潤和NSCLC患者的整體生存呈正相關(guān)。

2.      CCL7缺失損害了cDC1在TME中的浸潤以及隨后CD8 ⁺和CD4 ⁺ T細(xì)胞在支氣管引流淋巴結(jié)和TME中的擴(kuò)增，從而促進(jìn)了KP小鼠模型中的腫瘤發(fā)展。

3.      CCL7單獨或與抗PD-1聯(lián)合肺內(nèi)給藥可顯著抑制KP小鼠和KL小鼠的腫瘤發(fā)展并延長其生存期。

參考文獻(xiàn)：

Man Zhang, Wei Yang, Peng Wang, et al. CCL7 recruits cDC1 to promote antitumor immunity and facilitate checkpoint immunotherapy to non-small cell lung cancer. Nature communication. 2020.