活久見 脂肪能保護(hù)小鼠免受中風(fēng)損害

移植的間充質(zhì)干細(xì)胞（MSCs）在臨床前中風(fēng)模型中通過分泌細(xì)胞外囊泡（EVs）可以產(chǎn)生神經(jīng)保護(hù)作用。但是，尚未發(fā)現(xiàn)EV裝載的神經(jīng)保護(hù)作用物質(zhì)。為了研究此類物質(zhì)及其潛在機(jī)制，將原代神經(jīng)元暴露于氧-葡萄糖剝奪（OGD）中，并與脂肪來源的MSC（ADMSC）或分泌了ADMSC的EV共培養(yǎng)。在這種情況下，ADMSC和分泌出ADMSC的EV均可顯著減少神經(jīng)元死亡。進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)ADMSC通過EV轉(zhuǎn)移miR-25減少中風(fēng)小鼠的自噬達(dá)到神經(jīng)保護(hù)作用。本文于2020年10月發(fā)表在《J Extracell Vesicles》IF：14.976雜志上。

技術(shù)路線如下：

主要內(nèi)容如下：

1、純化，分離和表征ADMSC-EV

首先使用兩種方法UC和PEG從ADMSC中分離出EV，然后使用WB，透射電鏡TEM和NTA分析鑒定分離的囊泡顆粒的特征，如圖1a-c所示，獲得的囊泡顆粒表面表達(dá)CD9，CD63，Alix，TSG101，但是不表達(dá)albumin，Histone，TOMM20，且UC和PEG兩種方法獲得EV沒有差別，NTA顯示大小都在100 nm左右，并具有典型的EV形態(tài)，但大小不同。

PEG程序可能無法區(qū)分EV與非EV納米粒子和蛋白質(zhì)，所以作者接下來鑒定獲得的納米顆粒是來源于UC還是PEG樣品。首先使用自形成的碘克沙醇（OptiPrep）對通過UC或PEG分離的EV梯度亞分離（圖1d）。分離后對各個亞組分進(jìn)行WB鑒定，如圖1e，UC組和PEG組的EV樣品大多以分?jǐn)?shù)7的形式存在。NTA顯示，無論選擇何種富集方法，絕大多數(shù)EV都是分?jǐn)?shù)7。此外，組分7的EV的典型大小是30-150nm（圖1g）。因此，因此，碘化醇梯度中可以分離出具有不同浮力密度和大小的EVs亞型，無論采用何種分離方法，小型EVs (sEVs，直徑50至200 nm)在第七餾分中富集程度最高。

在隨后的實(shí)驗(yàn)中，收集了組分7作為純化的sEVs (iodixanol)，用于進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)。尺寸排阻色譜(SEC)被認(rèn)為是從不同基質(zhì)中分離純化EV的最佳方法之一。然后將UC或PEG分離的EV應(yīng)用于SEC柱過濾后收集。UCSEC和PEG-SEC的特征是基于大小分布和EV富集蛋白的存在。WB分析顯示UC-SEC和PEG-SEC都富集了EV標(biāo)記(如CD9、CD63和Alix)，過濾后的和未處理的沒有差異(圖1h)。圖1i給出了基于NTA的具有代表性的UC-SEC和PEG-SEC的尺寸分布曲線，該曲線反映了UC-SEC和PEG-SEC相似的尺寸分布規(guī)律，峰值大約在100 nm處。

圖1 ADMSC-EV的表征和純化

2、ADMSC-EVs通過調(diào)節(jié)自噬來保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞免受氧葡萄糖剝奪(OGD)損傷

隨后，作者分析了ADMSC-EVs誘導(dǎo)的神經(jīng)保護(hù)在中風(fēng)模型中潛在機(jī)制。體外模型時將原代神經(jīng)元暴露于OGD中24小時后再氧化，根據(jù)缺血再灌注時間的不同，表現(xiàn)出明顯程度的細(xì)胞損傷（圖2a）。盡管最近的研究表明自噬參與了缺氧或缺血誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷，但已發(fā)表的數(shù)據(jù)似乎在自噬是有益還是有害這一問題上存在矛盾。因此，作者分析了模型中的自噬水平。其中LC3-II水平與細(xì)胞損傷程度顯著相關(guān)，表現(xiàn)為缺血再灌注10小時的神經(jīng)元中LC3-II含量明顯高于缺血再灌注4小時或8小時的神經(jīng)元(圖2b-c)。之后，所有的實(shí)驗(yàn)均采用10小時OGD暴露。與對照組相比，用ADMSCs或UC或PEG分離的EV處理暴露于OGD的原代神經(jīng)元，細(xì)胞損傷顯著減少(圖2d)。但就存活率而言，EV處理的并不比ADMSCs處理的差。

為了探究ADMSCs來源的EV增強(qiáng)原代神經(jīng)元細(xì)胞對OGD的抗性是否通過調(diào)節(jié)自噬活性，評估了自噬蛋白的表達(dá)。當(dāng)初代神經(jīng)元暴露于OGD和與ADMSCs共培養(yǎng)或用ADMSCs來源的EV處理時中風(fēng)引起的LC3-II蛋白豐度增加的情況被反轉(zhuǎn)了（圖2e-f）。表明ADMSC-EVs可能通過調(diào)節(jié)自噬來保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞免受OGD損傷。

圖2ADMSC-EVs通過調(diào)節(jié)自噬來保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞免受氧葡萄糖剝奪(OGD)損傷

3、ADMSC-EVs通過p53和BNIP3信號傳導(dǎo)抑制自噬通量并增加細(xì)胞活力

LC3-II作為自噬的典型標(biāo)志物，但事實(shí)上，LC3-II水平的升高可能是自噬體形成增強(qiáng)的結(jié)果，也可能是自噬體與溶酶體融合不足的結(jié)果。為了區(qū)分自噬過程的這兩種狀態(tài)，通過bafilomycin A1 (BafA1)處理原代神經(jīng)元來評估自噬的效果，BafA1是一種有效的V - ATP酶抑制劑，可阻礙自噬體-溶酶體融合。如果自噬體的分解被阻斷，LC3-II的絕對值積累(處理過的BafA1減去未處理的BafA1)表明在特定時間內(nèi)產(chǎn)生了多少新的自噬體。與對照組相比，經(jīng)ADMSCs或EV培養(yǎng)的原代神經(jīng)元中，BafA1誘導(dǎo)的LC3-II積累量顯著降低(圖3a-b)。 采用串聯(lián)熒光RFP-GFP-LC3B報告系統(tǒng)監(jiān)測原代神經(jīng)元的自噬通量。用ADMSC-EVs孵育暴露于OGD的原代神經(jīng)元時，自噬體和自溶溶酶體的數(shù)量都減少了(圖3c-d)。

為了進(jìn)一步揭示ADMSC-EVs與自噬的關(guān)系，在暴露于OGD的原代神經(jīng)元中使用自噬激活劑雷帕霉素和抑制劑3-MA(圖3e)。不同濃度雷帕霉素與ADMSC-EVs聯(lián)合處理神經(jīng)元，可逆轉(zhuǎn)先前EV誘導(dǎo)的神經(jīng)保護(hù)作用，提示ADMSC-EVs與雷帕霉素的作用方式明顯相反。相反，使用3-MA以濃度依賴的方式顯著增強(qiáng)了細(xì)胞的活力（圖3e）。表明ADMSC-EVs通過抑制自噬通量并增加細(xì)胞活力。

眾所周知，自噬調(diào)節(jié)的4個信號通路包括p53和BNIP3。有趣的是，p53和BNIP3蛋白的表達(dá)水平在OGD暴露的原代神經(jīng)元細(xì)胞中都顯著升高了（圖3f-g）。但是，當(dāng)與ADMSC或ADMSC-EVs共培養(yǎng)顯著降低了OGD誘導(dǎo)的p53和BNIP3表達(dá)上調(diào)，表明ADMSC-EVs可能通過p53和BNIP3信號調(diào)節(jié)自噬。

圖3 ADMSC-EVs通過p53和BNIP3信號傳導(dǎo)抑制自噬通量并增加細(xì)胞活力

4、ADMSC-EVs對自噬通量的調(diào)節(jié)依賴于外泌體

為了確定外泌體在暴露于OGD的原代神經(jīng)元的自噬調(diào)節(jié)和神經(jīng)保護(hù)中的作用，用中性鞘磷脂酶靶向抑制劑GW4869抑制神經(jīng)酰胺合成，并通過敲除ESCRT-0復(fù)合物的一個成員Hrs（Hrs-KD）抑制ESCRT介導(dǎo)的外泌體生物發(fā)生。如預(yù)期地，Hrs-KD和GW4869預(yù)處理導(dǎo)致外泌體分泌下降（圖4a）。此外，當(dāng)外泌體分泌抑制劑GW4869或Hrs-KD預(yù)處理ADMSC時，ADMSC-EVs (EVs)對自噬調(diào)節(jié)(圖4b-c)和神經(jīng)保護(hù)(圖4d)的作用被明顯阻斷。共培養(yǎng)模型中應(yīng)用GW4869，當(dāng)外泌體分泌抑制劑GW4869預(yù)處理ADMSCs時，ADMSCs (EVs)對神經(jīng)保護(hù)(圖4d)和自噬調(diào)節(jié)(圖4e-f)的作用被明顯阻斷。重要的是，與ADMSC-EVs共同孵育可降低暴露于OGD的神經(jīng)元中p53和BNIP3的豐度，而與GW4869預(yù)處理的ADMSC獲得的EVs共同孵育的神經(jīng)元不能抑制p53和BNIP3蛋白水平(圖4g-h)。因此，形成ADMSC-EV亞群的外泌體似乎在介導(dǎo)暴露于OGD的原代神經(jīng)元ADMSC的抗自噬活性中起關(guān)鍵作用。

圖4 ADMSC-EVs對自噬通量的調(diào)節(jié)依賴于外泌體

5、ADMSC通過miR-25-3p調(diào)節(jié)自噬并誘導(dǎo)神經(jīng)保護(hù)

為了鑒定EV介導(dǎo)自噬的實(shí)際分子，挖掘了與p53/PTEN作用的miRNA。根據(jù)文獻(xiàn)可知，有10個miRNA被公認(rèn)為靶向p53，作者選擇了其中了6個用于qRT-PCR，結(jié)果發(fā)現(xiàn)miR-25-3p在EV中顯著高于其它分子（圖5a）。為了表明在本實(shí)驗(yàn)研究的條件下miR-25的物理化學(xué)狀態(tài)，用RNase A, Triton X-100清潔劑(破壞囊泡的脂質(zhì)雙層)，兩者都處理EV，或者單獨(dú)使用溶劑(對照)，通過RT-qPCR檢測miR-25的水平。結(jié)果表明與溶劑處理的信號相比，當(dāng)用RNase A處理EVs，而不是Triton X-100處理EVs時， miR-25的PCR信號保持在誤差范圍內(nèi)。這表明該柱捕獲的RNA位于小泡內(nèi)，因此脂質(zhì)雙分子層保護(hù)RNA不被RNase A消化(圖5b)。而RNase A和Triton X-100同時使用時miR-25的表達(dá)極低，這證實(shí)最初對消化的抗性是由于囊泡的隔離，當(dāng)Triton X-100消化掉保護(hù)作用的囊泡膜后，RNase A導(dǎo)致RNA幾乎全部被消化（圖5b），這證明miR-25在ADMSC-EV內(nèi)部。然而，當(dāng)神經(jīng)元細(xì)胞暴露于OGD時，初級神經(jīng)元中miR-25-3p的細(xì)胞內(nèi)濃度顯著降低（圖5c）。 相反，用ADMSC-EV治療原代神經(jīng)元會顯著增加miR-25-3p的濃度（圖5c）。

為了證實(shí)miR-25-3p的作用，從用anti-miR-25-3p 寡核苷酸預(yù)處理的ADMSC（ADMSC-EV^anti-miR-25）中分離EV，同時用scramble作對照（ADMSC-EV^NC），結(jié)果發(fā)現(xiàn)，暴露在OGD中后，與PBS預(yù)處理對照相比，ADMSC-EV^NC共培養(yǎng)的原代神經(jīng)元的細(xì)胞活力顯著更高，然而，這些作用在用ADMSC-EV^anti-miR-25處理時顯著消失（圖5d）。與PBS處理的細(xì)胞相比，在用ADMSC-EVs^NC培養(yǎng)的原代神經(jīng)元中，在OGD條件下，BafA1誘導(dǎo)的LC3-II積累的量也顯著降低（圖5e-f），而在用ADMSC-EV^anti-miR-25孵育神經(jīng)元時，這些結(jié)果再次反轉(zhuǎn)（圖5e-f）。同樣，使用螢光素酶系統(tǒng)發(fā)現(xiàn)，與ADMSC-EVs^NC孵育的神經(jīng)元相比，ADMSC-EVs^anti-miR-25（EVs^anti-miR-25）孵育的神經(jīng)元中自噬體和自溶體的數(shù)量顯著增加（圖5g-h）?？傊?，這些結(jié)果表明ADMSC來源的EV通過miR-25-3p調(diào)節(jié)自噬并誘導(dǎo)神經(jīng)保護(hù)。

圖5 ADMSC通過miR-25-3p調(diào)節(jié)自噬并誘導(dǎo)神經(jīng)保護(hù)

6、ADMSC-EVs誘導(dǎo)中風(fēng)的小鼠中持續(xù)的神經(jīng)保護(hù)并促進(jìn)神經(jīng)恢復(fù)

根據(jù)上述體外原代神經(jīng)元數(shù)據(jù)，進(jìn)一步探究ADMSC-EV改善中風(fēng)后神經(jīng)功能恢復(fù)是否通過調(diào)節(jié)自噬活性。首先檢查了缺血條件下EV的生物分布模式。與前面的研究結(jié)果一致，ADMSC - EV確實(shí)可以到達(dá)中樞神經(jīng)系統(tǒng)，至少在缺血性中風(fēng)的情況下是這樣（圖6a）。在再灌注開始時或再灌注后12 h內(nèi)，全身性注射稀釋于200μLPBS中的2×106 ADMSCs釋放的EV。與PBS對照相比，在再灌注開始時立即接受ADMSC-EV的小鼠表現(xiàn)出明顯更小的梗塞體積（圖6b-c）。同樣，在12小時內(nèi)用EV治療中風(fēng)小鼠時，梗死面積也明顯減少。與對照組相比，兩個EV組之間無顯著差異（圖6b-c）。伴隨著這種急性腦損傷的減少，行為測試分析顯示，在任一時間點(diǎn)，用EV治療的小鼠的測試得分更高（圖6d-e）。 值得注意的是，在轉(zhuǎn)彎和緊繩測試中，這種更好的測試性能是持久且穩(wěn)定的，直到14天的觀察期結(jié)束。隨后分析了中風(fēng)后14天缺血性紋狀體的神經(jīng)元存活情況。與減少神經(jīng)系統(tǒng)損傷相一致，在兩個注射時間點(diǎn)均用ADMSC-EV治療的小鼠中發(fā)現(xiàn)神經(jīng)元密度增加（圖6f-g）。結(jié)論是，在實(shí)驗(yàn)性卒中模型中，ADMSC衍生的EV在組織學(xué)和功能水平上均減少了中風(fēng)后腦損傷。

7、MCAO后ADMSC-EV給藥通過p53-BNIP3信號傳導(dǎo)降低自噬通量

為了探究自噬抑制對神經(jīng)保護(hù)的作用，使用3-MA抑制自制在大腦中動脈閉塞（MCAO）后，評估神經(jīng)元存活和神經(jīng)恢復(fù)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)無論是MCAO后抑制自噬顯著增加的細(xì)胞存活，但是在中風(fēng)后12小時3-MA給藥處理能更好的促進(jìn)神經(jīng)恢復(fù)，而在再灌注發(fā)生的0小時處理只能部分增強(qiáng)神經(jīng)恢復(fù)（圖6d-e）。而在中風(fēng)后12小時3-MA給藥處理神經(jīng)元密度顯著增強(qiáng)，但0小時是估計(jì)沒有影響（圖6f-g）。同樣，當(dāng)在這些動物中同時使用BafA1時，在12 h用3-MA治療中風(fēng)小鼠會顯著降低手術(shù)后24 h的自噬通量，與PBS組相比，這些小鼠的LC3-II水平顯著降低（圖6h-i）。與此相反，在再灌注開始時0小時立即用3-MA處理對自噬通量沒有影響。 這些結(jié)果表明，調(diào)節(jié)中風(fēng)后過度激活的自噬活性可在MCAO誘導(dǎo)后在小鼠中發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。

圖6 EV引起的自噬調(diào)節(jié)可減少中風(fēng)后腦損傷并改善神經(jīng)功能。

8、ADMSC-EVs中miR-25-3p的丟失減少了中風(fēng)后EV誘導(dǎo)的自噬和神經(jīng)保護(hù)調(diào)節(jié)

為了確認(rèn)與ADMSC-EV給藥相關(guān)的自噬通量的降低是由miR-25-3p的EV介導(dǎo)的，給小鼠注射了PBS和ADMSC-EV，后者用antimiR25-3p（EVs^anti-miR25）預(yù)處理的過，或已用對照寡核苷酸（EVs^NC）預(yù)處理過。注射是在MCAO手術(shù)后12小時完成的。 再灌注24小時后，與PBS組相比，ADMSC-EV和ADMSC-EVs^NC組中，缺血性紋狀體中BafA1誘導(dǎo)的LC3-II積累均顯著降低（圖7a-b）。但是，ADMSC-EVs^anti-miR25的處理未能顯示出對自噬通量的類似作用（圖7a-b）。

一致地，與對照組和用ADMSC-EVs^anti-miR25治療的小鼠相比，用ADMSC-EVs^NC治療的小鼠通過轉(zhuǎn)彎和緊繩試驗(yàn)評估的神經(jīng)系統(tǒng)恢復(fù)得到增強(qiáng)（圖7c-d）。 MCAO 14天后對神經(jīng)元密度的分析顯示，與用ADMSC-EVs^anti-miR25治療的動物相比，用ADMSC-EVs^NC治療的小鼠顯示出腦損傷減少。因此，從ADMSC衍生的EV最終可在組織學(xué)和功能水平上減少腦損傷。 MCAO后與ADMSC-EV給藥相關(guān)的抗自噬活性至少部分由miR-25-3p的EV介導(dǎo)。

圖7 ADMSC-EVs中miR-25-3p的丟失減少了中風(fēng)后EV誘導(dǎo)的自噬和神經(jīng)保護(hù)調(diào)節(jié)

圖8源自ADMSC-EV的miR-25-3p在臨床前中風(fēng)模型中的作用示意圖。

總之，ADMSC釋放富含miR-25-3p的EV，這些EV會被神經(jīng)元攝取。在神經(jīng)元中，miR-25-3p誘導(dǎo)p53 mRNA的降解，從而導(dǎo)致p53蛋白水平的下調(diào)和隨后BNIP3的降低。反過來，對BNIP3的抑制作用會進(jìn)一步降低自噬水平，從而發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。

參考文獻(xiàn)：

Kuang Yaoyun., Zheng Xuan., Zhang Lin., Ai Xiaoyu., Venkataramani Vivek., Kilic Ertugrul., Hermann Dirk M., Majid Arshad., B?hr Mathias., Doeppner Thorsten R.(2020). Adipose-derived mesenchymal stem cells reduce autophagy in stroke mice by extracellular vesicle transfer of miR-25. J Extracell Vesicles, 10(1), e12024. doi:10.1002/jev2.12024