負(fù)載STING激活劑c-di-GMP的介孔二氧化硅納米顆粒對(duì)乳腺癌的免疫治療增強(qiáng)

研究背景：

逆轉(zhuǎn)免疫抑制腫瘤微環(huán)境(TME)是提高腫瘤免疫治療敏感性的一項(xiàng)戰(zhàn)略舉措。最新研究表明，環(huán)二鳥(niǎo)苷酸(c-di-GMP或cdG)可誘導(dǎo)干擾素基因刺激因子(STING)途徑激活抗原呈遞細(xì)胞(APCs)，增強(qiáng)腫瘤免疫原性。但是，研究顯示cdG在血漿中清除快，膜通透性差，細(xì)胞內(nèi)生物利用度不足。因此，Yi-Ping Chen在ACS Appl Mater Interfaces(IF=8.758)這一雜志發(fā)表文章，探索一種基于納米藥物的全面的原位接種方法，以觸發(fā)抗腫瘤免疫。

技術(shù)路線圖：

研究結(jié)果：

1.    RMSN-PEG-TA的制備與表征

采用經(jīng)典的軟模板法合成帶有熒光RITC的單分散二氧化硅納米微球(MSNs) ，并進(jìn)一步用PEG和TA進(jìn)行了修飾，所獲得的納米顆粒命名為RMSN-PEG-TA， TEM圖像顯示其平均直徑為26.7±4.8 nm(Figures 1a).。MSN直徑非常小，能夠很容易的通過(guò)腫瘤基質(zhì)。MSN聚乙二醇化，用DLS確定平均大小，顯示在完全培養(yǎng)基中較好的分散性。平均直徑為46.6 ±0.3 nm(Figure 1b)。RMSN-PEG-TA的等電點(diǎn)(IEP)為8.87，在pH 7.4條件下表面電位約為+28 mV，適合細(xì)胞攝取和載藥實(shí)驗(yàn)（Figure1c）。如Figure 1d所示，RMSN-PEG-TA的氮?dú)馕矫摳降葴鼐€為IV型，總Brunauer Emmett Teller (BET)表面積為36m²/g。用BJH法計(jì)算得到的平均孔徑為2.3 nm。

Figure 1

2. 在體外，cdG@RMSN-PEG-TA納米顆粒處理激活免疫細(xì)胞因子的產(chǎn)生。

用不同劑量的RMSN-PEG-TA培養(yǎng)RAW 264.7細(xì)胞6小時(shí)，觀察熒光密度（Figure 2a）。在37℃條件下，4.42% PEG- cdG體外釋放譜指定時(shí)間為300/PBS。我們觀察到85%的cdG在8小時(shí)內(nèi)釋放（Figure 2b）。為了證實(shí)cdG通過(guò)STING依賴的信號(hào)通路觸發(fā)免疫反應(yīng)。cdG@RMSN-PEG-TA處理后，參與STING激活的IL-1β, IFN-β和IL-6水平顯著升高。RMSN-PEG-TA和free cdG不觸發(fā)細(xì)胞因子的表達(dá)。cdG通過(guò)調(diào)節(jié)STING-TBK1-IRF3通路影響一型干擾素的產(chǎn)生，刺激固有免疫應(yīng)答。WB結(jié)果顯示cdG和cdG@

RMSN-PEG-TA處理組中STING磷酸化水平顯著增加。結(jié)果顯示RMSN-PEG-TA能夠引起STING的激活，導(dǎo)致免疫因子的產(chǎn)生。

Figure 2

3.體內(nèi)，cdG@RMSN-PEGTA的抗腫瘤作用增強(qiáng)

研究顯示，CDNs（循環(huán)二核苷酸）可通過(guò)STING依賴信號(hào)通路刺激固有免疫和適應(yīng)性免疫，導(dǎo)致腫瘤退化。接下來(lái)文章評(píng)估cdG@RMSNPEG-TA在接種4T1乳腺癌BALB/c小鼠中的抗腫瘤作用。cdG能夠部分抑制腫瘤生長(zhǎng)，cdG@RMSN-PEG-TA顯示顯著的抗腫瘤作用，這種作用可能是由于細(xì)胞吸收更好和cdG的原位持續(xù)釋放(Figure 3b)。體重沒(méi)有減輕說(shuō)明在實(shí)驗(yàn)中沒(méi)有表現(xiàn)出毒性作用(Figure 3c)。cdG@RMSN-PEG-TA處理組腫瘤最小(Figure 3d)，cdG@RMSNPEG-TA組平均腫瘤重量比對(duì)照組低近4倍，比游離cdG組低2.18倍。

為了直接評(píng)估腫瘤的增殖情況，我們進(jìn)一步通過(guò)免疫組化方法分析了腫瘤切片中核蛋白Ki-67的表達(dá)情況。Ki-67在cdG@RMSNPEG-TA治療后表達(dá)最低(圖4a)，這與腫瘤抑制研究結(jié)果一致。染色發(fā)現(xiàn)cdG@RMSN-PEG-TA可以誘導(dǎo)更高水平的STING 磷酸化(p-Ser365)，這表明通過(guò)STING依賴的信號(hào)通路可以抑制腫瘤生長(zhǎng)(圖4b)。

Figure 3

Figure 4

4. cdG@RMSN-PEG-TA納米顆粒注射觸發(fā)TME內(nèi)免疫反應(yīng)。

據(jù)報(bào)道，TME中STING通路的激活可促進(jìn)淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)，從而介導(dǎo)癌癥免疫治療。接下來(lái)，我們研究了攜帶4t1的Balb/c小鼠TME內(nèi)抗腫瘤免疫的激活。如圖3a所示，在第15天收集腫瘤，進(jìn)行免疫熒光和流式細(xì)胞術(shù)分析。cdG@RMSN-PEG-TA處理24小時(shí)后，仍有3%的分離細(xì)胞檢測(cè)出RITC陽(yáng)性，表明cdG@RMSN-PEG-TA確實(shí)被在體內(nèi)吞噬(圖5a)。如圖5b所示，我們發(fā)現(xiàn)空的陽(yáng)離子RMSN-PEG-TA僅略微增強(qiáng)腫瘤中CD 45+白細(xì)胞、Ly6C+單核細(xì)胞和CD 4+ T細(xì)胞總數(shù)，而對(duì)CD11c+樹(shù)突狀細(xì)胞、F4/80+巨噬細(xì)胞和CD 8+ T細(xì)胞無(wú)影響。考慮到RMSN-PEG-TA單獨(dú)不能抑制腫瘤生長(zhǎng)，且體重沒(méi)有變化(圖3b，c)，我們假設(shè)RMSN-PEG-TA免疫原性較弱。游離cdG處理組，腫瘤中F4/80+巨噬細(xì)胞、cd4 + T細(xì)胞、cd8 + T細(xì)胞明顯增多。腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞的增強(qiáng)提示STING激動(dòng)劑可以激活TME內(nèi)的APCs，進(jìn)而進(jìn)一步激活下游的適應(yīng)性免疫反應(yīng)，導(dǎo)致細(xì)胞毒性T細(xì)胞的招募。與可溶性cdG相比，cdG@RMSN-PEG-TA制劑能顯著促進(jìn)STING激動(dòng)劑刺激的腫瘤浸潤(rùn)白血病細(xì)胞，包括CD11c+樹(shù)突狀細(xì)胞、F4/ 80+巨噬細(xì)胞、CD 4+ T細(xì)胞和CD 8+ T細(xì)胞。cdg@rmsn - peg - tatated組腫瘤中cd8 + T細(xì)胞的百分比是cdG處理組的7.9倍。結(jié)果表明cdG@RMSN-PEG-TA治療刺激了腫瘤中的淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)，導(dǎo)致了較低的免疫抑制TME，這與我們的腫瘤回歸研究一致。

由于樹(shù)突狀細(xì)胞通常被認(rèn)為是STING依賴免疫反應(yīng)的關(guān)鍵角色，隨后分析了cdG@RMSN-PEGTA在腫瘤微環(huán)境中的定位，重點(diǎn)分析了CD11c+樹(shù)突狀細(xì)胞的群體。流式細(xì)胞儀結(jié)果顯示，CD11c+樹(shù)突狀細(xì)胞非常有效地吸收了給予的納米顆粒，特別是在cdG@RMSN-PEG-TA納米顆粒治療后(圖5c)。免疫組化染色分別在腫瘤組織切片上證實(shí)細(xì)胞核定位，DAPI染色(藍(lán)色)和抗cd11c抗體染色(綠色)的樹(shù)突狀細(xì)胞定位(圖5d)。在merge并后的圖像中觀察到CD11c+細(xì)胞與cdG@RMSN-PEG-TA (紅色)的共定位，這與圖5c的流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果一致。

Figure 5