負(fù)載STING激活劑c-di-GMP的介孔二氧化硅納米顆粒對(duì)乳腺癌的免疫治療增強(qiáng)

欄目:最新研究動(dòng)態(tài) 發(fā)布時(shí)間:2021-04-20
逆轉(zhuǎn)免疫抑制腫瘤微環(huán)境(TME)是提高腫瘤免疫治療敏感性的一項(xiàng)戰(zhàn)略舉措。最新研究表明,環(huán)二鳥苷酸(c-di-GMP或cdG)可誘導(dǎo)干擾素......


研究背景:

逆轉(zhuǎn)免疫抑制腫瘤微環(huán)境(TME)是提高腫瘤免疫治療敏感性的一項(xiàng)戰(zhàn)略舉措。最新研究表明,環(huán)二鳥苷酸(c-di-GMPcdG)可誘導(dǎo)干擾素基因刺激因子(STING)途徑激活抗原呈遞細(xì)胞(APCs),增強(qiáng)腫瘤免疫原性。但是,研究顯示cdG在血漿中清除快,膜通透性差,細(xì)胞內(nèi)生物利用度不足。因此,Yi-Ping ChenACS Appl Mater Interfaces(IF=8.758)這一雜志發(fā)表文章,探索一種基于納米藥物的全面的原位接種方法,以觸發(fā)抗腫瘤免疫。

技術(shù)路線圖:


研究結(jié)果:

1.    RMSN-PEG-TA的制備與表征

采用經(jīng)典的軟模板法合成帶有熒光RITC的單分散二氧化硅納米微球(MSNs) ,并進(jìn)一步用PEGTA進(jìn)行了修飾,所獲得的納米顆粒命名為RMSN-PEG-TA, TEM圖像顯示其平均直徑為26.7±4.8 nm(Figures 1a).MSN直徑非常小,能夠很容易的通過腫瘤基質(zhì)。MSN聚乙二醇化,用DLS確定平均大小,顯示在完全培養(yǎng)基中較好的分散性。平均直徑為46.6 ±0.3 nm(Figure 1b)RMSN-PEG-TA的等電點(diǎn)(IEP)8.87,在pH 7.4條件下表面電位約為+28 mV,適合細(xì)胞攝取和載藥實(shí)驗(yàn)(Figure1c)。如Figure 1d所示,RMSN-PEG-TA的氮?dú)馕矫摳降葴鼐€為IV型,總Brunauer Emmett Teller (BET)表面積為36m2/g。用BJH法計(jì)算得到的平均孔徑為2.3 nm。

Figure 1

2. 在體外,cdG@RMSN-PEG-TA納米顆粒處理激活免疫細(xì)胞因子的產(chǎn)生。

用不同劑量的RMSN-PEG-TA培養(yǎng)RAW 264.7細(xì)胞6小時(shí),觀察熒光密度Figure 2a)。在37℃條件下,4.42% PEG- cdG體外釋放譜指定時(shí)間為300/PBS。我們觀察到85%cdG8小時(shí)內(nèi)釋放(Figure 2b)。為了證實(shí)cdG通過STING依賴的信號(hào)通路觸發(fā)免疫反應(yīng)。cdG@RMSN-PEG-TA處理后,參與STING激活的IL-1β, IFN-βIL-6水平顯著升高。RMSN-PEG-TAfree cdG不觸發(fā)細(xì)胞因子的表達(dá)。cdG通過調(diào)節(jié)STING-TBK1-IRF3通路影響一型干擾素的產(chǎn)生,刺激固有免疫應(yīng)答。WB結(jié)果顯示cdGcdG@

RMSN-PEG-TA處理組中STING磷酸化水平顯著增加。結(jié)果顯示RMSN-PEG-TA能夠引起STING的激活,導(dǎo)致免疫因子的產(chǎn)生。

Figure 2

3.體內(nèi),cdG@RMSN-PEGTA的抗腫瘤作用增強(qiáng)

研究顯示,CDNs(循環(huán)二核苷酸)可通過STING依賴信號(hào)通路刺激固有免疫和適應(yīng)性免疫,導(dǎo)致腫瘤退化。接下來文章評(píng)估cdG@RMSNPEG-TA在接種4T1乳腺癌BALB/c小鼠中的抗腫瘤作用。cdG能夠部分抑制腫瘤生長,cdG@RMSN-PEG-TA顯示顯著的抗腫瘤作用,這種作用可能是由于細(xì)胞吸收更好和cdG的原位持續(xù)釋放(Figure 3b)。體重沒有減輕說明在實(shí)驗(yàn)中沒有表現(xiàn)出毒性作用(Figure 3c)。cdG@RMSN-PEG-TA處理組腫瘤最小(Figure 3d)cdG@RMSNPEG-TA組平均腫瘤重量比對(duì)照組低近4倍,比游離cdG組低2.18倍。

為了直接評(píng)估腫瘤的增殖情況,我們進(jìn)一步通過免疫組化方法分析了腫瘤切片中核蛋白Ki-67的表達(dá)情況。Ki-67cdG@RMSNPEG-TA治療后表達(dá)最低(4a),這與腫瘤抑制研究結(jié)果一致。染色發(fā)現(xiàn)cdG@RMSN-PEG-TA可以誘導(dǎo)更高水平的STING 磷酸化(p-Ser365)這表明通過STING依賴的信號(hào)通路可以抑制腫瘤生長(4b)。

Figure 3

Figure 4

4. cdG@RMSN-PEG-TA納米顆粒注射觸發(fā)TME內(nèi)免疫反應(yīng)。

據(jù)報(bào)道,TMESTING通路的激活可促進(jìn)淋巴細(xì)胞浸潤,從而介導(dǎo)癌癥免疫治療。接下來,我們研究了攜帶4t1Balb/c小鼠TME內(nèi)抗腫瘤免疫的激活。如圖3a所示,在第15天收集腫瘤,進(jìn)行免疫熒光和流式細(xì)胞術(shù)分析。cdG@RMSN-PEG-TA處理24小時(shí)后,仍有3%的分離細(xì)胞檢測(cè)出RITC陽性,表明cdG@RMSN-PEG-TA確實(shí)被在體內(nèi)吞噬(5a)。如圖5b所示,我們發(fā)現(xiàn)空的陽離子RMSN-PEG-TA僅略微增強(qiáng)腫瘤中CD 45+白細(xì)胞、Ly6C+單核細(xì)胞和CD 4+ T細(xì)胞總數(shù),而對(duì)CD11c+樹突狀細(xì)胞、F4/80+巨噬細(xì)胞和CD 8+ T細(xì)胞無影響??紤]到RMSN-PEG-TA單獨(dú)不能抑制腫瘤生長,且體重沒有變化(3b,c),我們假設(shè)RMSN-PEG-TA免疫原性較弱。游離cdG處理組,腫瘤中F4/80+巨噬細(xì)胞、cd4 + T細(xì)胞、cd8 + T細(xì)胞明顯增多。腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞的增強(qiáng)提示STING激動(dòng)劑可以激活TME內(nèi)的APCs,進(jìn)而進(jìn)一步激活下游的適應(yīng)性免疫反應(yīng),導(dǎo)致細(xì)胞毒性T細(xì)胞的招募。與可溶性cdG相比,cdG@RMSN-PEG-TA制劑能顯著促進(jìn)STING激動(dòng)劑刺激的腫瘤浸潤白血病細(xì)胞,包括CD11c+樹突狀細(xì)胞、F4/ 80+巨噬細(xì)胞、CD 4+ T細(xì)胞和CD 8+ T細(xì)胞。cdg@rmsn - peg - tatated組腫瘤中cd8 + T細(xì)胞的百分比是cdG處理組的7.9倍。結(jié)果表明cdG@RMSN-PEG-TA治療刺激了腫瘤中的淋巴細(xì)胞浸潤,導(dǎo)致了較低的免疫抑制TME這與我們的腫瘤回歸研究一致。

由于樹突狀細(xì)胞通常被認(rèn)為是STING依賴免疫反應(yīng)的關(guān)鍵角色,隨后分析了cdG@RMSN-PEGTA在腫瘤微環(huán)境中的定位,重點(diǎn)分析了CD11c+樹突狀細(xì)胞的群體。流式細(xì)胞儀結(jié)果顯示,CD11c+樹突狀細(xì)胞非常有效地吸收了給予的納米顆粒,特別是在cdG@RMSN-PEG-TA納米顆粒治療后(5c)。免疫組化染色分別在腫瘤組織切片上證實(shí)細(xì)胞核定位,DAPI染色(藍(lán)色)和抗cd11c抗體染色(綠色)的樹突狀細(xì)胞定位(5d)。在merge并后的圖像中觀察到CD11c+細(xì)胞與cdG@RMSN-PEG-TA (紅色)的共定位,這與圖5c的流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果一致。

Figure 5