通過單細(xì)胞RNA測(cè)序分析原發(fā)性胃腺癌的轉(zhuǎn)錄異質(zhì)性

腫瘤異質(zhì)性包括形態(tài)異質(zhì)性和遺傳異質(zhì)性一直是腫瘤研究的熱點(diǎn)，因?yàn)樗鼘?duì)準(zhǔn)確診斷和個(gè)體化治療都提出了一系列挑戰(zhàn)。胃腺癌（GA）是一種異質(zhì)性惡性疾病的典型代表，具有不同的亞型和臨床表現(xiàn)。

單細(xì)胞RNA測(cè)序（scRNA-seq）和微流控技術(shù)的進(jìn)展為科研工作者提供了同時(shí)描述數(shù)千個(gè)細(xì)胞轉(zhuǎn)錄狀態(tài)的方法。該方法允許對(duì)生物組織內(nèi)的細(xì)胞特征進(jìn)行分析，并已廣泛應(yīng)用于包括癌癥免疫異質(zhì)性在內(nèi)的腫瘤生態(tài)系統(tǒng)分析。另一方面，放大內(nèi)鏡下的靶向活檢仍然是最準(zhǔn)確的GA診斷方法，因?yàn)樗试S臨床醫(yī)生觀察病變并捕獲富含腫瘤細(xì)胞的組織。結(jié)合內(nèi)鏡活檢的單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組實(shí)驗(yàn)將有助于更準(zhǔn)確的遺傳病病理診斷。

今天我們來講一篇關(guān)于單細(xì)胞RNA測(cè)序分析原發(fā)性胃腺癌的轉(zhuǎn)錄異質(zhì)性的文獻(xiàn)，文章題名為：Dissecting transcriptional heterogeneity in primary gastric adenocarcinoma by single cell RNA sequencing，發(fā)表于GUT雜志，影響因子19.819。該文章主要對(duì)9個(gè)GA腫瘤樣本和3個(gè)非腫瘤樣本的27677個(gè)細(xì)胞進(jìn)行了無(wú)偏轉(zhuǎn)錄組的scRNA-seq分析。

不同GA類型的單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組圖譜

為了研究各種病變胃粘膜內(nèi)的細(xì)胞群和相關(guān)分子特征，樣本選取5個(gè)腸道組織學(xué)GA樣本，3個(gè)混合組織學(xué)GA樣本，1個(gè)彌漫組織學(xué)GA樣本和3個(gè)對(duì)照樣本。去除低質(zhì)量細(xì)胞后，保留27677個(gè)細(xì)胞用于生物學(xué)分析，每個(gè)細(xì)胞檢測(cè)到1227個(gè)基因和3809個(gè)轉(zhuǎn)錄物。在基因表達(dá)標(biāo)準(zhǔn)化和主成分分析（PCA）之后，使用基于圖的聚類將細(xì)胞劃分為14個(gè)聚類。這些簇可通過標(biāo)記基因分配給9個(gè)已知的細(xì)胞譜系：上皮細(xì)胞（10411細(xì)胞，37.6%，用EPCAM、KRT18和KRT8標(biāo)記）、壁細(xì)胞（215細(xì)胞，0.8%，用ATP4A標(biāo)記）、內(nèi)分泌細(xì)胞（486細(xì)胞，1.8%，用CHGA標(biāo)記）；B細(xì)胞（6131細(xì)胞，22.1%，用MS4A1和CD79A標(biāo)記）；T細(xì)胞（6819細(xì)胞，24.6%，用CD2、CD3D和CD3E標(biāo)記）；巨噬細(xì)胞（1053細(xì)胞，3.8%，用CD14標(biāo)記）；肥大細(xì)胞（527細(xì)胞，1.9%，用CPA3標(biāo)記）；成纖維細(xì)胞（1116細(xì)胞，4.0%，用ACTA2和COL1A2標(biāo)記）；內(nèi)皮細(xì)胞（919細(xì)胞，3.3%，用ENG和VWF標(biāo)記）。每個(gè)細(xì)胞譜系的比例在不同的樣本中差異很大（圖1F）。

惡性與非惡性上皮的分類

為了區(qū)分惡性和非惡性上皮，利用k-means聚類算法，根據(jù)初始評(píng)分定義惡性上皮細(xì)胞和非惡性上皮細(xì)胞。由于TCGA大塊組織的初始識(shí)別由于包含非上皮細(xì)胞而存在偏差，接下來在假定的惡性和非惡性上皮細(xì)胞之間產(chǎn)生差異表達(dá)基因，重新計(jì)算惡性/非惡性評(píng)分并分類上皮細(xì)胞。重復(fù)這個(gè)過程，直到分類結(jié)果穩(wěn)定為止。最后，鑒定了5635個(gè)惡性上皮細(xì)胞和4776個(gè)非惡性上皮細(xì)胞。一組腫瘤特異性基因（CLDN4、CLDN7、TFF3和REG4），在惡性上皮上調(diào)。非惡性上皮表現(xiàn)出與胃粘液和消化酶分泌相關(guān)的標(biāo)記基因的高表達(dá)，如MUC5AC、GKN1、PGC和LIPF。為了研究惡性和非惡性上皮的分子特征差異，又進(jìn)行了基因集富集分析（GSEA）。與非惡性上皮相比，惡性上皮富含TNF-α/NF-κB、KRAS和IL-6/JAK/信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)子和轉(zhuǎn)錄激活子。還有其他對(duì)癌癥發(fā)展和進(jìn)展至關(guān)重要的富集基因集，如MYC靶點(diǎn)、上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化和血管生成。

轉(zhuǎn)錄組分析揭示了主細(xì)胞、頸細(xì)胞和SPEM之間的關(guān)系

慢性炎癥引起的癌前胃化生一直是胃癌發(fā)生研究的熱點(diǎn)。一些研究已經(jīng)報(bào)道，主要細(xì)胞可能異常分化為頸部細(xì)胞，然后由于壁細(xì)胞的丟失而導(dǎo)致粘液細(xì)胞化生，稱為SPEM。根據(jù)數(shù)據(jù)，在癌組織和CG粘膜組織樣本中很少檢測(cè)到表達(dá)ATP4A和ATP4B的壁細(xì)胞。還對(duì)非惡性細(xì)胞進(jìn)行亞聚類，發(fā)現(xiàn)了四個(gè)不同的組。G1組細(xì)胞占細(xì)胞總數(shù)的78.0%，通過TFF2、GKN1和MUC5AC基因的表達(dá)可區(qū)分為表面細(xì)胞。G2組的細(xì)胞表現(xiàn)出高水平的標(biāo)記基因，如PGA3、PGA4和LIPF，并被定義為主要細(xì)胞。還發(fā)現(xiàn)G3細(xì)胞表達(dá)標(biāo)志物PGA3和MUC6，可定義為增生性/肥大性粘液頸部細(xì)胞，免疫染色也驗(yàn)證了表達(dá)。

G4簇主要由癌變粘膜細(xì)胞組成。這些細(xì)胞的特征是頸部細(xì)胞標(biāo)記物MUC6、化生轉(zhuǎn)錄物TFF2、CD44和SOX9以及主要組織相容性復(fù)合體II類（MHC-II）基因的高表達(dá)水平。免疫染色還顯示，主細(xì)胞、頸細(xì)胞和SPEM共存于同一組織中，并且從胃腺基部到腺頸逐漸按主細(xì)胞、頸細(xì)胞和SPEM的順序排列，支持主細(xì)胞到頸細(xì)胞到SPEM的過渡推斷。接下來進(jìn)一步研究細(xì)胞類型之間的潛在轉(zhuǎn)換。從Monocle得到的時(shí)間軌跡軸表明，主細(xì)胞可以轉(zhuǎn)分化為粘膜頸細(xì)胞，然后再分化為SPEM。特定代表性基因的時(shí)間表達(dá)動(dòng)力學(xué)也標(biāo)志著主要細(xì)胞向粘膜頸部細(xì)胞的進(jìn)展，然后進(jìn)入SPEM。本文的結(jié)果首次在單細(xì)胞水平上描繪了主細(xì)胞的潛在分化途徑，并表明它們可能產(chǎn)生化生細(xì)胞。

GA惡性細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄異質(zhì)性

對(duì)5635個(gè)惡性細(xì)胞進(jìn)行聚類分析，發(fā)現(xiàn)了5個(gè)顯著的細(xì)胞亞群（C1-C5）。惡性細(xì)胞主要根據(jù)Lauren的組織病理學(xué)類型和背景因素（EBV感染）進(jìn)行分組。觀察到，9名患者的C1-C5比例不同。C1幾乎全部（96.9%）來自彌漫型樣本（DGC），而C2主要來自腸型樣本（IGC）（97.1%）。C3含有混合型（MGC）和腸型樣本細(xì)胞的混合物。C4主要來源于一個(gè)腸型GC樣本（IGC3），C5包括來自EBV+患者（IGC5）的細(xì)胞。通過比較基因表達(dá)譜，我們發(fā)現(xiàn)C1/C2/C3與Lauren分類的三個(gè)典型亞型一致，C4/C5是兩個(gè)新的細(xì)胞亞型，與C1/C2/3相比具有明顯的分子特征。

經(jīng)典Lauren組織病理類型GA的分子特征

接下來我們研究了C1、C2和C3的分子特征（圖5A）。C1高表達(dá)一些在胃上皮細(xì)胞中廣泛表達(dá)的基因（如CLDN18和TFF2）（圖5B），但在C2中很少檢測(cè)到這些基因。相反，C2表現(xiàn)出與小腸相似的重要分子特征，這是由腸細(xì)胞標(biāo)記物（如APOA1和FABP2）的廣泛表達(dá)所支持的（圖5C）。這些結(jié)果也通過KRT20和CLDN18免疫染色進(jìn)行了驗(yàn)證（在線補(bǔ)充圖S7）。C3沒有顯示出明顯的分子特征，但部分表達(dá)了C1和C2的兩個(gè)標(biāo)記，表明它是C1和C2的中間亞群，而不是C1和C2的混合物。此外，我們觀察到三個(gè)亞組之間的分化分?jǐn)?shù)不同（圖5D）。PHGR1、KRT20和MDK的表達(dá)水平在C2中最高，在C3中中等，但在C1中最低（圖5E）。這些結(jié)果表明，C1代表一個(gè)未分化狀態(tài)的亞群，C2代表一個(gè)不同的具有成熟腸細(xì)胞特征的分化良好的惡性細(xì)胞亞群，C3代表C1和C2之間的中間狀態(tài)。我們的結(jié)果描繪了單細(xì)胞分辨率下不同勞倫組織類型的獨(dú)特分子特征。

GA-FG-CCP的轉(zhuǎn)錄組分析

C4的惡性細(xì)胞主要來自腸型GA樣品IGC3。H&E染色結(jié)果顯示腫瘤位于胃底腺，主要由分化的顆粒細(xì)胞組成。scRNA-seq數(shù)據(jù)顯示C4廣泛表達(dá)主要細(xì)胞標(biāo)記物（如LIPF、PGC和PGA3），并且表現(xiàn)出中等水平的分化評(píng)分。我們鑒定了一些在C4中特異表達(dá)的基因，其中一些被報(bào)道調(diào)控Wnt/β-catenin通路，即RNF43 35。GO富集分析證實(shí)C4中的特征基因富集用于調(diào)節(jié)生長(zhǎng)和Wnt/β-catenin通路。免疫熒光染色顯示，這些細(xì)胞主要分布在胃腺體基底部，MUC6和胃蛋白酶原-I（PGA3）強(qiáng)烈共表達(dá)。C4亞組細(xì)胞的組織病理學(xué)表現(xiàn)和表型表達(dá)模式與GA-FG-CCP的細(xì)胞特征高度一致。

總的來說，該研究為破譯胃腫瘤異質(zhì)性提供了寶貴的資源，這將為精確診斷和預(yù)后提供幫助。