circNDUFB2通過使IGF2BP不穩(wěn)定并激活抗腫瘤免疫力來抑制非小細(xì)胞肺癌的進(jìn)展

肺癌是最常被診斷的癌癥之一，也是導(dǎo)致癌癥死亡的主要原因，非小細(xì)胞肺癌（NSCLC）約占肺癌病例的85％。環(huán)狀RNA（circRNA）是一類共價閉合的單鏈RNA，與癌癥的發(fā)展有關(guān)。今天我們來看一篇發(fā)表在Nature Communications期刊的一篇文章，題名為：circNDUFB2 inhibits non-small cell lung cancer progression via destabilizing IGF2BPs and activating anti-tumor immunity。

circNDUFB2在NSCLC中被下調(diào)

通過circRNA芯片分析了三對NSCLC樣品中circRNA的表達(dá)譜，總共鑒定出109個circRNA失調(diào)，33個上調(diào)，76個下調(diào)。qRT-PCR驗(yàn)證52個配對NSCLC樣品中前五差異circRNA的表達(dá)。circNDUFB2是最顯著下調(diào)的circRNA。臨床分析發(fā)現(xiàn)circNDUFB2高表達(dá)與NSCLC患者的腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和分期呈負(fù)相關(guān)。結(jié)果表明，circNDUFB2在NSCLC中經(jīng)常被下調(diào)，并且與NSCLC的惡性特征呈負(fù)相關(guān)。circNDUFB2由NDUFB2基因的外顯子2–3產(chǎn)生，長度為249 nt。circNDUFB2可由發(fā)散引物擴(kuò)增，收斂引物不能擴(kuò)增。核酸酶消化證實(shí)circNDUFB2具有閉環(huán)結(jié)構(gòu)。放線菌素D處理表明，與NDUFB2 mRNA相比，circNDUFB2是穩(wěn)定的。核質(zhì)分離PCR以及熒光原位雜交（FISH）顯示circNDUFB2主要定位于細(xì)胞質(zhì)中。這些結(jié)果表明circNDUFB2是一個circRNA。

QKI促進(jìn)NSCLC細(xì)胞中circNDUFB2的生物發(fā)生

circNDUFB2和NDUFB2均來自NDUFB2 pre-mRNA，而NDUFB2 mRNA在NSCLC中略有上調(diào)。因此，推測circNDUFB2的下調(diào)在轉(zhuǎn)錄后發(fā)生。我們在circNDUFB2中搜索與潛在QRE匹配的序列。接下來進(jìn)行了RIP分析，確認(rèn)QKI確實(shí)與NDUFB2 pre-mRNA中的假定QRE結(jié)合。在NSCLC細(xì)胞中QKI過表達(dá)可能會上調(diào)circNDUFB2。 這些數(shù)據(jù)表明，QKI與NDUFB2 pre-mRNA的circNDUFB2形成外顯子側(cè)翼的內(nèi)含子結(jié)合，從而促進(jìn)circNDUFB2的形成。

circNDUFB2抑制NSCLC進(jìn)展

體外研究表明circNDUFB2過表達(dá)顯著抑制了NSCLC細(xì)胞的增殖，遷移和侵襲，而circNDUFB2敲低顯著促進(jìn)了這些表型。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)表明circNDUFB2過表達(dá)可顯著抑制NSCLC細(xì)胞的致瘤性和轉(zhuǎn)移。這些數(shù)據(jù)表明circNDUFB2可能在NSCLC進(jìn)展中起抑制作用。

circNDUFB2與NSCLC細(xì)胞中的IGF2BP1/2/3相互作用

為了探索circNDUFB2是否通過與蛋白質(zhì)相互作用發(fā)揮功能，RNA pulldown來鑒定與其相關(guān)的蛋白質(zhì)。RNApulldown沉淀物通過SDS-PAGE分離。銀染后，切下約65 kDa的有義特異性條帶，并使用質(zhì)譜進(jìn)行分析。發(fā)現(xiàn)前三個豐富的蛋白質(zhì)分別是IGF2BP2，IGF2BP1和IGF2BP3。使用Western blot和RIP分析證實(shí)了這一結(jié)果。此外， RNA FISH免疫熒光分析，發(fā)現(xiàn)circNDUFB2與IGF2BPs共定位在細(xì)胞質(zhì)中。為了探討IGF2BPs的KH域?qū)τ谂ccircNDUFB2之間的相互作用，構(gòu)建IGF2BPs突變體，KH結(jié)構(gòu)域突變明顯減少了IGF2BP與circNDUFB2之間的相互作用。接下來進(jìn)行了circNDUFB2突變，發(fā)現(xiàn)circNDUFB2突變顯著降低了IGF2BP與circNDUFB2之間的相互作用。

IGF2BP結(jié)合區(qū)域包含“ GGAC” N6-甲基腺苷（m6A）核心基序。IGF2BPs是m6A結(jié)合蛋白。為了探索circRNA和IGF2BP之間的相互作用是否通過m6A依賴性的方式進(jìn)行調(diào)節(jié)，對circNDUFB2進(jìn)行了MeRIP，并觀察到circNDUFB2中m6A的顯著富集。敲低METTL3和METTL14顯著降低了circNDUFB2中m6A修飾的水平，并且沒有改變circNDUFB2的水平。METTL3 / 14敲低顯著削弱了circNDUFB2和IGF2BP之間的相互作用。 這些數(shù)據(jù)表明，circNDUFB2以依賴于m6A的方式與三個IGF2BP物理相互作用。

circNDUFB2過表后IGF2BPs的mRNA無顯著變化，蛋白質(zhì)水平顯著降低。此外，circNDUFB2突變體不影響IGF2BPs的蛋白質(zhì)水平。因此推測circNDUFB2可能通過相互作用使IGF2BP蛋白失穩(wěn)。發(fā)現(xiàn)circNDUFB2的過度表達(dá)顯著降低了IGF2BP蛋白的水平，這可以通過MG132（蛋白酶抑制劑）恢復(fù)。circNDUFB2顯著增加了IGF2BPs的泛素化水平，但這種作用因其突變而受損。這些結(jié)果表明circNDUFB2通過促進(jìn)泛素/蛋白酶體依賴性降解降低IGF2BPs的穩(wěn)定性。

TRIM25是介導(dǎo)IGF2BP泛素化的E3連接酶

為了進(jìn)一步鑒定IGF2BPs泛素化的E3連接酶，RNA pulldown質(zhì)譜結(jié)果中在156種潛在的相互作用蛋白中發(fā)現(xiàn)了兩種E3連接酶TRIM25和HECTD3。 使用WB分析， TRIM25與circNDUFB2特異性相關(guān)。 RIP分析進(jìn)一步證實(shí)了circNDUFB2與TRIM25的關(guān)聯(lián)。RNA FISH免疫熒光分析表明circNDUFB2與TRIM25在細(xì)胞質(zhì)中共定位。進(jìn)行Co-IP結(jié)果顯示TRIM25與所有三個IGF2BP結(jié)合。免疫熒光分析表明TRIM25與所有三個IGF2BP蛋白共定位在細(xì)胞質(zhì)中。IGF2BPs的mRNA水平不受TRIM25的影響，但是在TRIM25敲低時，IGF2BPs的蛋白水平顯著增加，而在TRIM25的過表達(dá)中，IGF2BPs的蛋白水平分別降低。在TRIM25過表達(dá)的A549細(xì)胞中，IGF2BP的泛素化水平顯著增加。這些結(jié)果表明，TRIM25是E3泛素連接酶，可與IGF2BP蛋白相互作用，并通過泛素-蛋白酶體途徑降解NSCLC細(xì)胞。

TRIM25的RNA結(jié)合活性對于其對底物的泛素連接酶活性是必需的。構(gòu)建了一個帶有FLAG標(biāo)記RNA結(jié)合域（RBD）缺失突變體。TRIM25ΔRBD不影響IGF2BPs的蛋白質(zhì)水平，對IGF2BPs的泛素化水平?jīng)]有明顯影響，表明TRIM25完整的RBD對于IGF2BPs的有效泛素化和降解是必要的。這些結(jié)果表明，TRIM25通過泛素-蛋白酶體途徑促進(jìn)NSCLC細(xì)胞中IGF2BPs的降解，并且TRIM25的RNA結(jié)合活性對其在底物泛素化中的作用至關(guān)重要。

已經(jīng)顯示，TRIM25使用RNA作為其靶標(biāo)有效泛素化的支架。然后，探討了TRIM25對IGF2BPs的泛素連接酶活性是否取決于circNDUFB2的存在。 circNDUFB2的丟失顯示了TRIM25對IGF2BPs泛素化和降解的顯著減弱作用。進(jìn)一步驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)并檢查circNDUFB2是否充當(dāng)支架來增強(qiáng)TRIM25與IGF2BP的結(jié)合，進(jìn)行了Co-IP分析。在帶有circNDUFB2但沒有circNDUFB2-MUT過表達(dá)的A549細(xì)胞中，TRIM25和IGF2BP之間的關(guān)聯(lián)得到增強(qiáng)。由于circNDUFB2對RNA核酸外切酶的抗性，使用RNase A治療會嚴(yán)重破壞相互作用。此外，在METTL3 / 14敲低后，IGF2BP的泛素化作用顯著降低。結(jié)果表明，circNDUFB2充當(dāng)支架，以增強(qiáng)TRIM25和IGF2BPs之間的相互作用，隨后促進(jìn)TRIM25介導(dǎo)的IGF2BPs泛素化和降解。

IGF2BPs是circNDUFB2的下游功能性蛋白

IGF2BPs是致癌蛋白，circNDUFB2可降低IGF2BPs的穩(wěn)定性，推測IGF2BPs介導(dǎo)circNDUFB2對NSCLC進(jìn)展的影響。IGF2BPs過表達(dá)顯著增加了A549細(xì)胞的遷移和侵襲能力以及集落形成能力。IGF2BPs敲除顯著降低H1650細(xì)胞的遷移和侵襲能力以及集落形成能力。這些結(jié)果證實(shí)IGF2BPs是NSCLC的促瘤因子。隨后，觀察到IGF2BPs過度表達(dá)僅部分恢復(fù)了circNDUFB2過度表達(dá)減少的遷移和侵襲能力以及集落形成能力，表明circNDUFB2部分通過降解IGF2BPs發(fā)揮腫瘤抑制作用。盡管circNDUFB2 MUT不影響IGF2BPs的蛋白質(zhì)水平但它仍然對NSCLC細(xì)胞的進(jìn)展具有抑制作用。這些數(shù)據(jù)表明circNDUFB2 MUT的抑制作用除了降解IGF2BPs外，還可能與circNDUFB2的其他機(jī)制有關(guān)。

circNDUFB2觸發(fā)NSCLC細(xì)胞的免疫防御反應(yīng)

為了研究參與circNDUFB2的信號通路，使用RNA測序（RNA-seq）進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組分析。結(jié)果表明circNDUFB2過表達(dá)影響934個基因的表達(dá)水平，其中743個基因上調(diào)，191個基因被下調(diào)?；虮倔w生物學(xué)過程（GO_BP）和KEGG途徑富集分析表明circNDUFB2觸發(fā)了免疫防御和I型干擾素（IFNs）信號傳導(dǎo)?；蚣患治觯?/span>GSEA）也表明目標(biāo)基因的信號傳導(dǎo)途徑參與了免疫反應(yīng)。確認(rèn)了在circNDUFB2過表達(dá)的NSCLC細(xì)胞中一組免疫基因表達(dá)被上調(diào)，而circNDUFB2敲低降低了NSCLC細(xì)胞中這些基因的水平。這些結(jié)果表明，過量表達(dá)circNDUFB2，而不是其具有相同序列的線性RNA片段，導(dǎo)致免疫基因上調(diào)。 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）證實(shí)circNDUFB2過表達(dá)顯著增加了細(xì)胞培養(yǎng)上清液中CXCL10，CXCL11，CCL5和IFNβ的水平，而circNDUFB2敲低降低了細(xì)胞培養(yǎng)上清液中這些細(xì)胞因子的水平。這些結(jié)果證明circNDUFB2在NSCLC細(xì)胞中引發(fā)免疫應(yīng)答。

RIG-I對circNDUFB2誘導(dǎo)的免疫反應(yīng)至關(guān)重要

RIG-I樣受體（RLR）家族可識別病毒RNA 會通過產(chǎn)生IFN和促炎性細(xì)胞因子來觸發(fā)針對病毒感染的先天免疫反應(yīng)。已經(jīng)報(bào)道外源circRNA有效刺激由RIG-1介導(dǎo)的免疫信號傳導(dǎo)。從qRT-PCR分析獲得的數(shù)據(jù)表明，RIG-1敲低消除了circNDUFB2過表達(dá)誘導(dǎo)的免疫反應(yīng)，RIG-1被circNDUFB2上調(diào)。為了研究circNDUFB2和RIG-I之間的關(guān)聯(lián)，進(jìn)行RIP分析和RNA FISH免疫熒光實(shí)驗(yàn)。 結(jié)果表明circNDUFB2與RIG-1結(jié)合，并且它們共定位在細(xì)胞質(zhì)中。 circNDUFB2過表達(dá)后， circNDUFB2顯著上調(diào)了RIG-1，IRF7，IFNβ和TNF的蛋白水平，而circNDUFB2則不影響P65和IRF3的蛋白水平。同時，circNDUFB2顯著增加了p-P65，p-IRF3，p-STAT1和p-STAT2。circNDUFB2還促進(jìn)了IRF3和P65進(jìn)入核內(nèi)的易位。免疫熒光分析證實(shí)circNDUFB2促進(jìn)了IRF3的磷酸化，并隨后觸發(fā)其轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核中。更重要的是，RIG-1的敲除顯著消除了這些基因的蛋白質(zhì)水平或磷酸化水平的上調(diào)以及由circNDUFB2誘導(dǎo)的A549細(xì)胞中IRF3和P65的核易位。ELISAs測量細(xì)胞培養(yǎng)上清液中的細(xì)胞因子水平，發(fā)現(xiàn)RIG-1敲低顯著消除了對CXCL10，CXCL11，CCL5和IFNβ的誘導(dǎo)。上述結(jié)果表明RIG-1在介導(dǎo)NSCLC細(xì)胞中circNDUFB2的免疫應(yīng)答中起關(guān)鍵作用，而circNDUFB2引發(fā)的免疫應(yīng)答不依賴于circNDUFB2中m6A的修飾。

在沒有RNA配體的情況下，RIG-I采用一種自動抑制的構(gòu)象，CARDs發(fā)出信號。因此假設(shè)circNDUFB2可能通過促進(jìn)其CARDs釋放激活RIG-I。用Co-IP檢測RIG-I的CARDs（FLAG-CARD）和螺旋酶結(jié)構(gòu)域（HA-ΔCARD）之間的相互作用。結(jié)果表明circNDUFB2抑制了RIG-I的CARDs和螺旋酶結(jié)構(gòu)域之間的相互作用。此外，circNDUFB2增強(qiáng)了CARDs與線粒體抗病毒信號蛋白（MAVS）的相互作用。這些結(jié)果表明circNDUFB2可能通過破壞CARDs與其解旋酶結(jié)構(gòu)域之間的分子內(nèi)相互作用來激活RIG-I，并使RIG-I保持活性，從而激活RIG-I-MAVS信號級聯(lián)。

circNDUFB2的免疫反應(yīng)抑制NSCLC進(jìn)展

為了研究circNDUFB2是否具有刺激免疫反應(yīng)的潛力，然后將免疫細(xì)胞募集到腫瘤微環(huán)境（TME）中，通過皮下將具有或不具有circNDUFB2過表達(dá)的LLC1（LL / 2，鼠肺癌細(xì)胞系）細(xì)胞遞送至C57BL / 6小鼠 注射。 三周后，我們發(fā)現(xiàn)circNDUFB2過表達(dá)顯著抑制了體內(nèi)LLC1細(xì)胞的致瘤性，而在CircNDUFB2過表達(dá)LLC1細(xì)胞的小鼠中血清IFNβ的水平顯著升高。此外，在從這些小鼠解剖的腫瘤組織中檢測到CD8 + T細(xì)胞和DC的浸潤，并且circNDUFB2過表達(dá)顯著增加了TME中CD8 + T細(xì)胞和DC的頻率。最后，分析了52例NSCLC患者腫瘤組織中circNDUFB2與RIG-I或IFNβ之間的相關(guān)性。結(jié)果表明circNDUFB2與RIG-1和IFNβ正相關(guān)。 以上結(jié)果表明，RIG-1介導(dǎo)的circNDUFB2的免疫反應(yīng)抑制了腫瘤的進(jìn)展。