脂質(zhì)積累與急性腎損傷

急性腎損傷(Acute kidney injury, AKI)是一種起病急、進展快、預后差的嚴重臨床急癥。最近的證據(jù)表明，AKI伴隨著顯著的代謝異常，包括脂質(zhì)代謝的改變。然而，脂質(zhì)在AKI中的具體變化及其作用和調(diào)控機制目前尚不清楚。今天小編給大家?guī)碛?/span>2021年3月發(fā)表在影響因子8.579的“Theranostics”的文章“Relieving lipid accumulation through UCP1 suppresses the progression of acute kidney injury by promoting the AMPK/ULK1/autophagy pathway”。本研究首次系統(tǒng)分析AKI中脂質(zhì)組成的變化，發(fā)現(xiàn)脂質(zhì)積累程度與UCP1高度相關。重要的是，通過上調(diào)UCP1緩解AKI中的脂質(zhì)堆積，可以通過促進AMPK/ULK1/自噬通路，顯著抑制AKI的進展。

技術路線

結果

1）AKI伴有明顯的脂質(zhì)積累，并與腎損傷的嚴重程度高度正相關

根據(jù)脂質(zhì)代謝組學分析結果，我們發(fā)現(xiàn)AKI組織中各類甘油三酯(TGs)含量顯著增加(圖1A)?？紤]到AKI中的脂質(zhì)積累，我們進行實驗來確定其臨床意義。我們對不同嚴重程度的AKI動物標本進行油紅O染色。結果顯示，隨著疾病進展的延長，小鼠腎組織脂質(zhì)沉積逐漸增加(圖1B)。在體外也發(fā)現(xiàn)了類似的結果，即隨著細胞損傷的嚴重程度，脂質(zhì)積累的程度增加(圖1C)。這些結果說明AKI中的脂質(zhì)積累與疾病的嚴重程度呈正相關。

2）UCP1在AKI中顯著下調(diào)，且與腎損傷嚴重程度呈高度負相關

UCPs超家族與能量代謝密切相關，并在多種疾病中介導脂質(zhì)消耗?；?/span>UCPs的功能，我們通過western blot和免疫組化方法對正常C57小鼠腎組織中UCP1、UCP2和UCP3的表達進行了表征。結果顯示，UCP1和UCP2表達較好，而UCP3幾乎未檢測到(圖2A-B)。在UCPs中，UCP1被認為是脂質(zhì)降解最關鍵的基因，而UCP2與之沒有直接關系。因此，我們選擇UCP1進行進一步分析，證實其在皮質(zhì)小管中高表達，在髓質(zhì)中部分表達，C57小鼠、Sprague-Dawley大鼠、Wistar大鼠腎小球、乳頭幾乎無表達(圖2C-D)。為了進一步確認UCP1在腎臟中的表達位點，我們用凝集素染色顯示腎臟的形態(tài)，然后對UCP1進行染色。結果顯示，UCP1主要表達于腎小管以上結果提示，UCP1可能在腎小管的結構和功能中發(fā)揮著潛在的重要作用。

為了探討UCP1與AKI之間的相關性，我們在體內(nèi)、體外檢測了UCP1在AKI模型中的表達。結果顯示，UCP1在AKI小鼠中顯著下調(diào)，更重要的是，隨著腎損傷的加重，其表達量逐漸降低(圖2E-F)。在體外，隨著順鉑刺激時間的延長，HK2細胞中UCP1的表達降低(圖2G)。這些結果表明UCP1與AKI的嚴重程度呈負相關。此外，隨著AKI腎細胞損傷程度的增加，脂質(zhì)的積累，UCP1的表達逐漸降低(圖2H)。這一結果表明，UCP1在AKI中的表達可能影響脂質(zhì)積累。

3）AKI中的脂質(zhì)積累與UCP1高度負相關

在確定了UCP1與AKI中的脂質(zhì)積累負相關后，我們試圖闡明其潛在的關系。首先，我們使用UCP1特異性過表達慢病毒載體和UCP1激動劑CL316243構建UCP1上調(diào)的細胞模型(圖3A)。如圖3B所示，UCP1過表達顯著降低了順鉑暴露HK2的脂質(zhì)積累。UCP1激動劑CL316243也得到了類似的結果。這些結果表明，UCP1參與了AKI中脂質(zhì)積累的調(diào)節(jié)。為了進一步驗證這一調(diào)控關系，提高證據(jù)的可靠性，我們采用腎多點注射UCP1特異性過表達腺病毒的方法建立AKI過表達UCP1的動物模型(圖3C-D)。油紅O染色顯示，過表達UCP1可顯著緩解AKI動物模型中的脂質(zhì)積累(圖3E)。最后，使用UCP1激動劑CL316243在AKI動物模型中誘導UCP1過表達，也觀察到了相同的結果(圖3F-H)。因此，所有證據(jù)表明，隨著UCP1表達的增加，AKI模型中的脂質(zhì)含量降低。

4）體外實驗表明，上調(diào)UCP1以減輕AKI期間的脂質(zhì)積累，可通過影響炎癥和凋亡，顯著抑制疾病進展

越來越多的證據(jù)表明，在AKI中有明顯的脂質(zhì)積累和UCP1的異常表達，并與腎損傷的嚴重程度有很強的相關性。為了確定脂質(zhì)積累是否影響AKI期間的細胞功能，我們首先使用UCP1過表達慢病毒和UCP1激動劑CL316243構建AKI細胞脂質(zhì)積累清除模型。如圖4A所示，在AKI中上調(diào)UCP1清除脂質(zhì)積聚，導致腎小管損傷指數(shù)、NGAL顯著下調(diào)，說明UCP1清除脂質(zhì)積聚可顯著減輕模型細胞的損傷。鑒于炎癥和凋亡是AKI細胞損傷最重要和直接的原因，我們對上述細胞模型中的炎癥和凋亡標記物進行了量化。IL-1β、IL-6和TNF-α隨著UCP1的上調(diào)而顯著降低(圖4B-D)。在凋亡指標Bax和C-caspase 3中也觀察到類似的趨勢，而Bcl-2升高(圖4E)。最后，通過TUNEL熒光染色直接定量評估細胞凋亡，證實上調(diào)UCP1緩解AKI模型細胞的凋亡(圖4F)。

5）上調(diào)UCP1緩解AKI期間的脂質(zhì)積累，顯著抑制疾病進展

為了在體內(nèi)驗證脂質(zhì)對AKI功能的影響，我們通過在腎臟多點注射過表達UCP1腺病毒，構建過表達UCP1動物模型，以消除脂質(zhì)在AKI中的堆積。在UCP1過表達動物模型中，腎損傷指標NGAL明顯降低(圖5A)。HE和PAS染色顯示腎臟形態(tài)有很大改善，腎小管損傷評分顯示，在UCP1介導的脂質(zhì)消耗增加后，腎小管損傷程度明顯降低(圖5B-C)。順鉑刺激后腎小管呈空泡變性，細胞扁平，管腔擴張，而UCP1過表達明顯改善了病理改變。血清肌酐(SCr)和尿素氮(BUN)這兩項腎臟損傷指標也出現(xiàn)了類似的顯著下降(圖5D-E)。利用UCP1激動劑CL316243在AKI動物模型中緩解脂堆積，進一步驗證了上述結果。治療后NGAL顯著降低(圖5F)，腎臟形態(tài)、腎小管損傷評分、SCr、BUN均顯著改善(圖5G-J)。因此，在體內(nèi)，上調(diào)UCP1以緩解AKI脂質(zhì)積累可以抑制AKI進展。

6）上調(diào)UCP1減輕AKI中的脂質(zhì)積累，可顯著緩解體內(nèi)炎癥和凋亡

以上研究證實，在體外，上調(diào)UCP1可以通過抑制炎癥和凋亡來抑制AKI的進展。為了探究其在體內(nèi)的作用，我們在腎多點注射模型中檢測了相應的指標。如圖6A-E所示，炎癥指標CD68、IL-1β、IL-6、TNF-α均顯著降低，UCP1上調(diào)。在凋亡方面，凋亡指標Bax和C-caspase 3也隨著UCP1的上調(diào)而降低，而Bcl-2隨著UCP1的上調(diào)而升高(圖6F)。TUNEL熒光染色也直接證明了UCP1上調(diào)導致的凋亡減少(圖6G-H)。同樣，我們也使用UCP1激動劑CL316243在動物模型中證實了同樣的炎癥和凋亡趨勢(圖6I-P)。

7）在體外，上調(diào)UCP1減少AKI期間的脂質(zhì)積累可通過AMPK/ULK1途徑促進自噬

自噬已被證實在AKI中發(fā)揮重要作用。因此，自噬已經(jīng)成為我們關注的重要途徑之一。在通過慢病毒轉染過表達UCP1或UCP1激動劑CL316243的AKI細胞模型中，自噬相關指標顯示AMPK/ULK1/自噬通路顯著激活(圖7A-B)。電子顯微鏡圖像也顯示，上調(diào)UCP1消除AKI中的脂質(zhì)積累后，細胞自噬得到促進(圖7C)?；谶@些發(fā)現(xiàn)，為了驗證自噬在UCP1功能中的重要性，我們進行了功能恢復實驗。如圖7D-F所示，氯喹抑制自噬顯著逆轉了順鉑組UCP1引起的炎癥指標下降。同樣，TUNEL染色顯示，使用氯喹抑制自噬，可以明顯逆轉UCP1促進的凋亡抑制作用(圖7G)。這些結果表明，脂質(zhì)積累通過作用于AKI細胞自噬，在調(diào)節(jié)細胞功能方面發(fā)揮著重要作用。

8）在AKI期間上調(diào)UCP1減少脂質(zhì)積累，可通過AMPK/ULK1途徑促進體內(nèi)自噬

我們發(fā)現(xiàn)UCP1在體外通過激活自噬來影響AKI中的細胞功能，我們探討了這種情況在體內(nèi)是否也會發(fā)生。結果表明，在動物模型中上調(diào)UCP1也能顯著激活AMPK/ULK1/自噬通路(圖8A)，免疫熒光和免疫組化分析進一步證實了這一點(圖8B-C)。最后，CL316243上調(diào)UCP1后，AMPK/ULK1/自噬通路也被顯著激活(圖8D-F)。綜上所述，我們的研究構建了AKI中脂質(zhì)積累顯著的模型，且這種積累的脂質(zhì)與UCP1呈負相關。通過上調(diào)UCP1來清除AKI中積累的脂質(zhì)，可以激活AMPK/ULK1/自噬通路來抑制疾病進展(圖9)。

結論：UCP1直接調(diào)控AKI中的脂質(zhì)積累，激活細胞自噬，從而顯著抑制疾病進展。這為AKI的治療提供了新的思路和靶點。