脂質(zhì)積累與急性腎損傷

急性腎損傷(Acute kidney injury, AKI)是一種起病急、進(jìn)展快、預(yù)后差的嚴(yán)重臨床急癥。最近的證據(jù)表明，AKI伴隨著顯著的代謝異常，包括脂質(zhì)代謝的改變。然而，脂質(zhì)在AKI中的具體變化及其作用和調(diào)控機(jī)制目前尚不清楚。今天小編給大家?guī)?lái)于2021年3月發(fā)表在影響因子8.579的“Theranostics”的文章“Relieving lipid accumulation through UCP1 suppresses the progression of acute kidney injury by promoting the AMPK/ULK1/autophagy pathway”。本研究首次系統(tǒng)分析AKI中脂質(zhì)組成的變化，發(fā)現(xiàn)脂質(zhì)積累程度與UCP1高度相關(guān)。重要的是，通過(guò)上調(diào)UCP1緩解AKI中的脂質(zhì)堆積，可以通過(guò)促進(jìn)AMPK/ULK1/自噬通路，顯著抑制AKI的進(jìn)展。

技術(shù)路線(xiàn)

結(jié)果

1）AKI伴有明顯的脂質(zhì)積累，并與腎損傷的嚴(yán)重程度高度正相關(guān)

根據(jù)脂質(zhì)代謝組學(xué)分析結(jié)果，我們發(fā)現(xiàn)AKI組織中各類(lèi)甘油三酯(TGs)含量顯著增加(圖1A)?？紤]到AKI中的脂質(zhì)積累，我們進(jìn)行實(shí)驗(yàn)來(lái)確定其臨床意義。我們對(duì)不同嚴(yán)重程度的AKI動(dòng)物標(biāo)本進(jìn)行油紅O染色。結(jié)果顯示，隨著疾病進(jìn)展的延長(zhǎng)，小鼠腎組織脂質(zhì)沉積逐漸增加(圖1B)。在體外也發(fā)現(xiàn)了類(lèi)似的結(jié)果，即隨著細(xì)胞損傷的嚴(yán)重程度，脂質(zhì)積累的程度增加(圖1C)。這些結(jié)果說(shuō)明AKI中的脂質(zhì)積累與疾病的嚴(yán)重程度呈正相關(guān)。

2）UCP1在AKI中顯著下調(diào)，且與腎損傷嚴(yán)重程度呈高度負(fù)相關(guān)

UCPs超家族與能量代謝密切相關(guān)，并在多種疾病中介導(dǎo)脂質(zhì)消耗?；?/span>UCPs的功能，我們通過(guò)western blot和免疫組化方法對(duì)正常C57小鼠腎組織中UCP1、UCP2和UCP3的表達(dá)進(jìn)行了表征。結(jié)果顯示，UCP1和UCP2表達(dá)較好，而UCP3幾乎未檢測(cè)到(圖2A-B)。在UCPs中，UCP1被認(rèn)為是脂質(zhì)降解最關(guān)鍵的基因，而UCP2與之沒(méi)有直接關(guān)系。因此，我們選擇UCP1進(jìn)行進(jìn)一步分析，證實(shí)其在皮質(zhì)小管中高表達(dá)，在髓質(zhì)中部分表達(dá)，C57小鼠、Sprague-Dawley大鼠、Wistar大鼠腎小球、乳頭幾乎無(wú)表達(dá)(圖2C-D)。為了進(jìn)一步確認(rèn)UCP1在腎臟中的表達(dá)位點(diǎn)，我們用凝集素染色顯示腎臟的形態(tài)，然后對(duì)UCP1進(jìn)行染色。結(jié)果顯示，UCP1主要表達(dá)于腎小管以上結(jié)果提示，UCP1可能在腎小管的結(jié)構(gòu)和功能中發(fā)揮著潛在的重要作用。

為了探討UCP1與AKI之間的相關(guān)性，我們?cè)隗w內(nèi)、體外檢測(cè)了UCP1在AKI模型中的表達(dá)。結(jié)果顯示，UCP1在AKI小鼠中顯著下調(diào)，更重要的是，隨著腎損傷的加重，其表達(dá)量逐漸降低(圖2E-F)。在體外，隨著順鉑刺激時(shí)間的延長(zhǎng)，HK2細(xì)胞中UCP1的表達(dá)降低(圖2G)。這些結(jié)果表明UCP1與AKI的嚴(yán)重程度呈負(fù)相關(guān)。此外，隨著AKI腎細(xì)胞損傷程度的增加，脂質(zhì)的積累，UCP1的表達(dá)逐漸降低(圖2H)。這一結(jié)果表明，UCP1在AKI中的表達(dá)可能影響脂質(zhì)積累。

3）AKI中的脂質(zhì)積累與UCP1高度負(fù)相關(guān)

在確定了UCP1與AKI中的脂質(zhì)積累負(fù)相關(guān)后，我們?cè)噲D闡明其潛在的關(guān)系。首先，我們使用UCP1特異性過(guò)表達(dá)慢病毒載體和UCP1激動(dòng)劑CL316243構(gòu)建UCP1上調(diào)的細(xì)胞模型(圖3A)。如圖3B所示，UCP1過(guò)表達(dá)顯著降低了順鉑暴露HK2的脂質(zhì)積累。UCP1激動(dòng)劑CL316243也得到了類(lèi)似的結(jié)果。這些結(jié)果表明，UCP1參與了AKI中脂質(zhì)積累的調(diào)節(jié)。為了進(jìn)一步驗(yàn)證這一調(diào)控關(guān)系，提高證據(jù)的可靠性，我們采用腎多點(diǎn)注射UCP1特異性過(guò)表達(dá)腺病毒的方法建立AKI過(guò)表達(dá)UCP1的動(dòng)物模型(圖3C-D)。油紅O染色顯示，過(guò)表達(dá)UCP1可顯著緩解AKI動(dòng)物模型中的脂質(zhì)積累(圖3E)。最后，使用UCP1激動(dòng)劑CL316243在AKI動(dòng)物模型中誘導(dǎo)UCP1過(guò)表達(dá)，也觀(guān)察到了相同的結(jié)果(圖3F-H)。因此，所有證據(jù)表明，隨著UCP1表達(dá)的增加，AKI模型中的脂質(zhì)含量降低。

4）體外實(shí)驗(yàn)表明，上調(diào)UCP1以減輕AKI期間的脂質(zhì)積累，可通過(guò)影響炎癥和凋亡，顯著抑制疾病進(jìn)展

越來(lái)越多的證據(jù)表明，在AKI中有明顯的脂質(zhì)積累和UCP1的異常表達(dá)，并與腎損傷的嚴(yán)重程度有很強(qiáng)的相關(guān)性。為了確定脂質(zhì)積累是否影響AKI期間的細(xì)胞功能，我們首先使用UCP1過(guò)表達(dá)慢病毒和UCP1激動(dòng)劑CL316243構(gòu)建AKI細(xì)胞脂質(zhì)積累清除模型。如圖4A所示，在AKI中上調(diào)UCP1清除脂質(zhì)積聚，導(dǎo)致腎小管損傷指數(shù)、NGAL顯著下調(diào)，說(shuō)明UCP1清除脂質(zhì)積聚可顯著減輕模型細(xì)胞的損傷。鑒于炎癥和凋亡是AKI細(xì)胞損傷最重要和直接的原因，我們對(duì)上述細(xì)胞模型中的炎癥和凋亡標(biāo)記物進(jìn)行了量化。IL-1β、IL-6和TNF-α隨著UCP1的上調(diào)而顯著降低(圖4B-D)。在凋亡指標(biāo)Bax和C-caspase 3中也觀(guān)察到類(lèi)似的趨勢(shì)，而Bcl-2升高(圖4E)。最后，通過(guò)TUNEL熒光染色直接定量評(píng)估細(xì)胞凋亡，證實(shí)上調(diào)UCP1緩解AKI模型細(xì)胞的凋亡(圖4F)。

5）上調(diào)UCP1緩解AKI期間的脂質(zhì)積累，顯著抑制疾病進(jìn)展

為了在體內(nèi)驗(yàn)證脂質(zhì)對(duì)AKI功能的影響，我們通過(guò)在腎臟多點(diǎn)注射過(guò)表達(dá)UCP1腺病毒，構(gòu)建過(guò)表達(dá)UCP1動(dòng)物模型，以消除脂質(zhì)在AKI中的堆積。在UCP1過(guò)表達(dá)動(dòng)物模型中，腎損傷指標(biāo)NGAL明顯降低(圖5A)。HE和PAS染色顯示腎臟形態(tài)有很大改善，腎小管損傷評(píng)分顯示，在UCP1介導(dǎo)的脂質(zhì)消耗增加后，腎小管損傷程度明顯降低(圖5B-C)。順鉑刺激后腎小管呈空泡變性，細(xì)胞扁平，管腔擴(kuò)張，而UCP1過(guò)表達(dá)明顯改善了病理改變。血清肌酐(SCr)和尿素氮(BUN)這兩項(xiàng)腎臟損傷指標(biāo)也出現(xiàn)了類(lèi)似的顯著下降(圖5D-E)。利用UCP1激動(dòng)劑CL316243在AKI動(dòng)物模型中緩解脂堆積，進(jìn)一步驗(yàn)證了上述結(jié)果。治療后NGAL顯著降低(圖5F)，腎臟形態(tài)、腎小管損傷評(píng)分、SCr、BUN均顯著改善(圖5G-J)。因此，在體內(nèi)，上調(diào)UCP1以緩解AKI脂質(zhì)積累可以抑制AKI進(jìn)展。

6）上調(diào)UCP1減輕AKI中的脂質(zhì)積累，可顯著緩解體內(nèi)炎癥和凋亡

以上研究證實(shí)，在體外，上調(diào)UCP1可以通過(guò)抑制炎癥和凋亡來(lái)抑制AKI的進(jìn)展。為了探究其在體內(nèi)的作用，我們?cè)谀I多點(diǎn)注射模型中檢測(cè)了相應(yīng)的指標(biāo)。如圖6A-E所示，炎癥指標(biāo)CD68、IL-1β、IL-6、TNF-α均顯著降低，UCP1上調(diào)。在凋亡方面，凋亡指標(biāo)Bax和C-caspase 3也隨著UCP1的上調(diào)而降低，而Bcl-2隨著UCP1的上調(diào)而升高(圖6F)。TUNEL熒光染色也直接證明了UCP1上調(diào)導(dǎo)致的凋亡減少(圖6G-H)。同樣，我們也使用UCP1激動(dòng)劑CL316243在動(dòng)物模型中證實(shí)了同樣的炎癥和凋亡趨勢(shì)(圖6I-P)。

7）在體外，上調(diào)UCP1減少AKI期間的脂質(zhì)積累可通過(guò)AMPK/ULK1途徑促進(jìn)自噬

自噬已被證實(shí)在AKI中發(fā)揮重要作用。因此，自噬已經(jīng)成為我們關(guān)注的重要途徑之一。在通過(guò)慢病毒轉(zhuǎn)染過(guò)表達(dá)UCP1或UCP1激動(dòng)劑CL316243的AKI細(xì)胞模型中，自噬相關(guān)指標(biāo)顯示AMPK/ULK1/自噬通路顯著激活(圖7A-B)。電子顯微鏡圖像也顯示，上調(diào)UCP1消除AKI中的脂質(zhì)積累后，細(xì)胞自噬得到促進(jìn)(圖7C)?；谶@些發(fā)現(xiàn)，為了驗(yàn)證自噬在UCP1功能中的重要性，我們進(jìn)行了功能恢復(fù)實(shí)驗(yàn)。如圖7D-F所示，氯喹抑制自噬顯著逆轉(zhuǎn)了順鉑組UCP1引起的炎癥指標(biāo)下降。同樣，TUNEL染色顯示，使用氯喹抑制自噬，可以明顯逆轉(zhuǎn)UCP1促進(jìn)的凋亡抑制作用(圖7G)。這些結(jié)果表明，脂質(zhì)積累通過(guò)作用于AKI細(xì)胞自噬，在調(diào)節(jié)細(xì)胞功能方面發(fā)揮著重要作用。

8）在AKI期間上調(diào)UCP1減少脂質(zhì)積累，可通過(guò)AMPK/ULK1途徑促進(jìn)體內(nèi)自噬

我們發(fā)現(xiàn)UCP1在體外通過(guò)激活自噬來(lái)影響AKI中的細(xì)胞功能，我們探討了這種情況在體內(nèi)是否也會(huì)發(fā)生。結(jié)果表明，在動(dòng)物模型中上調(diào)UCP1也能顯著激活AMPK/ULK1/自噬通路(圖8A)，免疫熒光和免疫組化分析進(jìn)一步證實(shí)了這一點(diǎn)(圖8B-C)。最后，CL316243上調(diào)UCP1后，AMPK/ULK1/自噬通路也被顯著激活(圖8D-F)。綜上所述，我們的研究構(gòu)建了AKI中脂質(zhì)積累顯著的模型，且這種積累的脂質(zhì)與UCP1呈負(fù)相關(guān)。通過(guò)上調(diào)UCP1來(lái)清除AKI中積累的脂質(zhì)，可以激活AMPK/ULK1/自噬通路來(lái)抑制疾病進(jìn)展(圖9)。

結(jié)論：UCP1直接調(diào)控AKI中的脂質(zhì)積累，激活細(xì)胞自噬，從而顯著抑制疾病進(jìn)展。這為AKI的治療提供了新的思路和靶點(diǎn)。