lncRNA VS骨形成

欄目:最新研究動(dòng)態(tài) 發(fā)布時(shí)間:2021-05-08
骨是一個(gè)動(dòng)態(tài)器官,通過(guò)破骨細(xì)胞和成骨細(xì)胞的協(xié)調(diào)產(chǎn)生自我修復(fù)潛力。衰老過(guò)程中骨的自我修復(fù)能力明顯受損。


導(dǎo)語(yǔ):骨是一個(gè)動(dòng)態(tài)器官,通過(guò)破骨細(xì)胞和成骨細(xì)胞的協(xié)調(diào)產(chǎn)生自我修復(fù)潛力。衰老過(guò)程中骨的自我修復(fù)能力明顯受損。間充質(zhì)骨祖細(xì)胞(OPCs)向骨形成表面的遷移是成骨細(xì)胞生成的初始步驟,OPCs的遷移能力在衰老過(guò)程中是否受到損害,以及它如何促成衰老相關(guān)的骨形成減少仍不清楚。今天,lncRNA粉墨登場(chǎng),演繹著不一樣的精彩故事。

參考文獻(xiàn):Targeting long noncoding RNA PMIF facilitates osteoprogenitor cells migrating to bone formation surface to promote bone formation during aging IF=8.579

 

技術(shù)路線:

                                              

結(jié)果

1. 衰老過(guò)程中骨形成減少伴隨OPCs向骨形成表面遷移減少,lnc-PMIF表達(dá)升高

收集衰老小鼠模型的骨標(biāo)本,分析動(dòng)態(tài)骨組織形態(tài),發(fā)現(xiàn)老年小鼠的礦化沉積率(MAR)和骨形成率(BFR/BS)均顯著降低,表明衰老期間小鼠的骨形成減少。從小鼠中分離出BMSCsRNA-Seq分析發(fā)現(xiàn)老年BMSCs中遷移相關(guān)基因均下調(diào)。老年和年輕小鼠BMSCs成骨誘導(dǎo)7dALP活性和成骨誘導(dǎo)14d后鈣礦物質(zhì)沉積相當(dāng),表明BMSCs的成骨潛能在衰老過(guò)程中沒(méi)有改變。再次從老年和年輕小鼠中分離BMSCs,Dil染色劑標(biāo)記后體外增殖,脛骨內(nèi)注射到另一批年輕小鼠中,三天后收獲脛骨對(duì)成骨標(biāo)志物Runx2進(jìn)行熒光免疫染色。發(fā)現(xiàn)老年BMSCs處理的小鼠中Dil標(biāo)記細(xì)胞降低,表明老化過(guò)程中OPCs向骨形成表面的遷移能力降低。大部分遷移到骨形成表面的Dil標(biāo)記細(xì)胞表達(dá)Runx2,表明OPCs遷移到骨形成表面發(fā)生成骨分化,有助于體內(nèi)骨形成。與年輕BMSCs相比,老年BMSCs的體外遷移能力明顯受損,Macf1顯著下調(diào),從Macf1基因位點(diǎn)轉(zhuǎn)錄而來(lái)的長(zhǎng)鏈非編碼RNA PMIF(即lnc-PMIF)表達(dá)顯著增高。上述提示,衰老過(guò)程中小鼠骨形成的減少伴隨著OPCs向骨形成表面遷移的減少和OPCslnc-PMIF表達(dá)的升高。

2. Lnc-PMIF抑制OPCs遷移到骨形成表面

在成骨細(xì)胞分化過(guò)程中,lnc-PMIF在早期增加,在礦化啟動(dòng)后減少,表明lnc-PMIF可能在成骨分化的早期階段發(fā)揮作用。過(guò)表達(dá)/敲低lnc-PMIF不影響OPCs的增殖和成骨分化。敲低lnc-PMIF的細(xì)胞遷移減弱,敲低組細(xì)胞處理的小鼠脛骨中Dil標(biāo)記細(xì)胞數(shù)量升高,小鼠中lnc-PMIF表達(dá)更高。這些表明lnc-PMIF可抑制OPCs向骨形成表面的遷移,而不干擾其增殖和成骨潛能。

3.Lnc-PMIFHuR相互作用抑制β-actin的表達(dá)以抑制OPC遷移

為探索Lnc-PMIF介導(dǎo)的OPC遷移的調(diào)節(jié)機(jī)制。RNA pull down-MS實(shí)驗(yàn)尋找lnc-PMIF的相互作用蛋白,鑒定出一種RNA結(jié)合蛋白HuR,WB證實(shí)HuR在生物素標(biāo)記的lnc-PMIF細(xì)胞裂解的下拉組分中富集,RNA免疫沉淀(RIP)試驗(yàn)lnc-PMIFHuR的結(jié)合。還檢測(cè)到β-肌動(dòng)蛋白顯著升高,與免疫沉淀的HuR蛋白結(jié)合。接下來(lái)研究HuR-β-actin介導(dǎo)的調(diào)節(jié)機(jī)制是否參與OPC的遷移調(diào)節(jié)。β-actinmRNA和蛋白表達(dá)以及細(xì)胞遷移能力在HuR基因過(guò)表達(dá)的細(xì)胞中顯著增加, HuR基因敲低細(xì)胞中降低。β-肌動(dòng)蛋白的mRNA和蛋白表達(dá)在lnc-PMIF過(guò)表達(dá)細(xì)胞中顯著下調(diào),但在lnc-PMIF基因敲除細(xì)胞中顯著上調(diào),表明lnc-PMIF能抑制OPCsβ-actin的表達(dá),基因過(guò)表達(dá)/敲除lnc-PMIF不改變HuR的蛋白表達(dá)。在前述lnc-PMIF敲低細(xì)胞中敲低HuR基因,細(xì)胞中β-actinmRNA和蛋白表達(dá)顯著下調(diào),細(xì)胞遷移能力也受到損害,這些數(shù)據(jù)表明lnc-PMIFHuR相互作用,抑制β-actin的表達(dá)來(lái)抑制OPC遷移。

 

4. lnc-PMIFHuRRRM3結(jié)合,中斷HuR-β-actin mRNA相互作用,抑制β-actin表達(dá),抑制OPC遷移

為闡明lnc-PMIF如何與HuR相互作用調(diào)節(jié)β-actin表達(dá)和OPC遷移,首先通過(guò)生物信息學(xué)分析預(yù)測(cè)了lnc-PMIF的二級(jí)結(jié)構(gòu),并合成生物素化的全長(zhǎng)lnc-PMIFWT)和截短的lnc-PMIF突變體,分別為突變體A1(無(wú)5’莖環(huán)的正義)、突變體A2(有中心莖環(huán)和3’莖環(huán)的正義)和突變體A3(僅有3’莖環(huán)的正義1100-1455 bp),轉(zhuǎn)染MC3T3-E1細(xì)胞,并進(jìn)行標(biāo)記RNA鏈霉親和素下拉試驗(yàn)。蛋白免疫印跡分析顯示,HuR存在于轉(zhuǎn)染WT lnc-PMIF、截短lnc-PMIF突變體A1或截短lnc-PMIF突變體A2的細(xì)胞的下拉部分中,但在轉(zhuǎn)染截短lnc-PMIF突變體A3的細(xì)胞的下拉部分中不存在。這些數(shù)據(jù)表明,lnc-PMIF的中心莖環(huán)足以實(shí)現(xiàn)lnc-PMIFHuR之間的相互作用。

接下來(lái),我們合成了野生型HuR蛋白(WT)HuR蛋白的截短突變體(即分別為單獨(dú)HuRRNA識(shí)別基序(RRM)1的突變體B1、單獨(dú)HuR RRM2的突變體B2和單獨(dú)HuR RRM3的突變體B3)(圖4 C)。同時(shí),我們?cè)O(shè)計(jì)并合成了生物素標(biāo)記的或未標(biāo)記的探針,分別特異性靶向lnc-PMIF的中心-莖環(huán)和生物素標(biāo)記的或未標(biāo)記的探針,特異性靶向之前報(bào)道的與HuR蛋白相互作用的β-actin mRNA的序列。RNA電泳遷移率變動(dòng)分析(EMSA)發(fā)現(xiàn)只有當(dāng)生物素標(biāo)記的lnc-PMIF探針與WT HuR或截短突變體B3共孵育時(shí),才能檢測(cè)到lnc-PMIF-HuR復(fù)合物,這表明HuRRRM3可介導(dǎo)HuRlnc-PMIF之間的相互作用。lnc-PMIFβ-actin mRNA競(jìng)爭(zhēng)與HuR相互作用。過(guò)表達(dá)HuR-RRM3后細(xì)胞中β-actinmRNA和蛋白表達(dá)下降顯著上調(diào),遷移活性增強(qiáng)。所有這些表明lnc-PMIF可與HuRRRM3結(jié)合,中斷HuR-β-actin的相互作用,抑制β-actin的表達(dá),抑制OPC的遷移。

5. 沉默lnc-PMIF促進(jìn)老年OPCs向骨形成表面遷移,促進(jìn)老年小鼠骨形成

BMSCs中沉默lnc-PMIF,增殖無(wú)變化,OPCs成骨能力不改變,細(xì)胞遷移數(shù)量高,表明沉默lnc-PMIF可增強(qiáng)老年OPCs的遷移能力,而不干擾老年OPCs的體外增殖和成骨分化。接受si-PMIF處理的老年BMSCs的小鼠中骨形成表面Dil +細(xì)胞數(shù)顯著升高,提示沉默lnc-PMIF可促進(jìn)老年OPCs在體內(nèi)向骨形成表面遷移,大部分遷移的Dil +細(xì)胞中檢測(cè)到Runx2表達(dá),表明si-PMIF處理的老年BMSCs遷移到骨形成表面發(fā)生正常的成骨分化,這將有助于小鼠的骨形成。接受si-PMIF處理的老年BMSCs小鼠骨表面TGF-β+細(xì)胞的平均積分光密度顯著更高,而TRAP+面積無(wú)顯著差異,表明si-PMIF處理的老化BMSCs可能影響細(xì)胞募集,而不是骨吸收。上述si-PMIFsi-NC處理的老年BMSCs對(duì)老年雄性小鼠進(jìn)行脛骨內(nèi)注射,4周后接受si-PMIF處理的老年BMSCs的小鼠骨量更高,脛骨干骺端微結(jié)構(gòu)更好,BMDBV/TV更高,MARBFR/BS更高。這些結(jié)果證明,老年BMSCs敲低lnc-PMIF可促進(jìn)骨形成。

6. 靶向遞送lnc-PMIF siRNA接近骨形成表面的OPCs促進(jìn)老年小鼠骨形成

接下來(lái)評(píng)價(jià)lnc-PMIF在骨形成表面周圍的老年OPCs中系統(tǒng)靶向沉默對(duì)衰老相關(guān)骨質(zhì)疏松的影響。為促進(jìn)lnc-PMIF siRNA(即si-PMIF)接近骨形成表面周圍的OPCs,si-PMIFsi-NC被包裹在骨形成表面靶向遞送系統(tǒng)(即,(DSS6)-脂質(zhì)體)。21月齡自然衰老的雄性和雌性小鼠靜脈注射 (DSS6)-脂質(zhì)體-si-PMIF、(DSS6)-脂質(zhì)體-si-NC(DSS6)-脂質(zhì)體單藥(溶劑)。si-PMIF處理組Gli1 +細(xì)胞中lnc-PMIF的表達(dá)顯著降低,si-PMIF處理組兩種性別小鼠的骨量更高,脛骨干骺端微結(jié)構(gòu)更好,BMDBV/TV更高,MARBFR/BS較高。這些發(fā)現(xiàn)表明,靶向沉默骨形成表面周圍OPCs中的lnc-PMIF可以促進(jìn)衰老相關(guān)骨質(zhì)疏松小鼠的骨形成。