NPM1突變急性髓系白血病的一種獨特亞型的生物學(xué)和治療意義
2021年，來自加拿大多倫多大學(xué)和加拿大溫哥華英屬哥倫比亞大學(xué)等團(tuán)隊合作在Nature communication雜志上發(fā)表了文章“Biological and therapeutic implications of a unique subtype of NPM1 mutated AML.”。此報道描述了npm1突變AML患者的分子異質(zhì)性?；?/span>rna-seq的基因表達(dá)譜分析，確定了兩種新亞型，稱為原始型和committed型?；诨虮磉_(dá)、表觀基因組(ATAC-seq)和免疫表型(CyToF)的差異，在獨立的AML隊列中將亞型與特定的分子特征、疾病分化狀態(tài)和患者生存聯(lián)系起來。此外，表明了在缺乏FLT3-ITD的原始特征病例的治療中添加激酶抑制劑對AML可能有治療益處。
急性髓系白血病(AML)是一種基因和生物學(xué)上的異質(zhì)性疾病，其特征是克隆擴(kuò)增和突變的造血干細(xì)胞和祖細(xì)胞分化受損。在AML最常見的驅(qū)動突變中，NPM1基因第12外顯子的4堿基對插入是穩(wěn)定的，在20% - 30%的病例中發(fā)生。由于其生物學(xué)意義和預(yù)后影響，NPM1突變在世界衛(wèi)生組織(WHO)的髓性白血病分類中代表了一個獨特的白血病實體，并在預(yù)后和治療決策中發(fā)揮重要作用。
NPM1突變通常與誘導(dǎo)和鞏固化療后患者生存的良好影響相關(guān)。在NPM1突變的AML中，FLT3- ITD突變經(jīng)常與DNMT3A突變同時發(fā)生，這本身與接受標(biāo)準(zhǔn)誘導(dǎo)治療的患者預(yù)后更差有關(guān)。大多數(shù)關(guān)于NPM1突變的AML的研究都集中在其他突變的同時發(fā)生，而突變型NPM1患者基因表達(dá)水平的異質(zhì)性及其生物學(xué)意義尚未得到全面研究。
技術(shù)路線：
一、NPM1突變的AML聚集成兩個不同的組
為了在391個npm1突變的AML樣本中定義一致的分子亞型，我們使用CoINcIDE12框架應(yīng)用元聚類方法。我們的元聚類分析顯示在我們的數(shù)據(jù)概要中有兩個穩(wěn)健的亞型(圖1A和補(bǔ)充圖1和2)。接下來，我們使用PERT算法13來闡明每個聚類中AML樣本的細(xì)胞組成。我們發(fā)現(xiàn)有一簇干細(xì)胞顯著富集，因此被標(biāo)記為原始。與此相反，另一簇與髓系和造血分化相關(guān)的基因表達(dá)豐富，因此我們將其標(biāo)記為committed亞型(圖1B)。兩個組在年齡、核型和白細(xì)胞計數(shù)等臨床病理參數(shù)方面沒有差異(卡方檢驗假發(fā)現(xiàn)率[FDR] >5%;補(bǔ)充表2 5)。確定關(guān)鍵驅(qū)動突變在原始和committed亞型中的分布(圖1C，補(bǔ)充討論中的亞型和突變部分和補(bǔ)充表6 17)。盡管亞型中富含某些突變(原始組的FLT3-ITD和承諾組的DNMT3A)，驅(qū)動突變的遺傳改變對原始和committed亞型的預(yù)測較差(補(bǔ)充圖3 16和補(bǔ)充討論)，基因突變和亞型之間的Matthews相關(guān)系數(shù)(MCC)較低(FLT3-ITD的MCC = 0.32, DNMT3A的MCC = 0.16;在precision-recall曲線(AUPRC = 0.62)值下，突變與亞型之間的多變量分析得到一個薄弱區(qū)域(Supplementary Fig. 7)。
二、npm1突變AML患者聚集的分子基礎(chǔ)
CDH2是鈣粘蛋白家族的一員，被認(rèn)為是決定干細(xì)胞命運(yùn)的調(diào)節(jié)因子15。類似地，G蛋白偶聯(lián)受體12 (GPR12)在原始亞型中上調(diào)，已知在干細(xì)胞維持和癌癥干細(xì)胞的體細(xì)胞重編程中發(fā)揮作用。MyoD家族抑制劑(MDFI)在原始亞型中表達(dá)增加，據(jù)報道它是WNT信號通路的調(diào)節(jié)因子，只在造血干細(xì)胞祖細(xì)胞中表達(dá)。鋅指蛋白521 (ZNF521)是一種轉(zhuǎn)錄因子，其在人類白血病細(xì)胞系中被敲低可以減少增殖但在原始亞型中卻有顯著的高表達(dá)。
CD163是一種免疫調(diào)節(jié)劑，是巨噬細(xì)胞清清體受體家族的成員，已知在單核細(xì)胞系的AML細(xì)胞中表達(dá)。在 committed cluster 中其他基因的高表達(dá)包括免疫相關(guān)基因，如C1QA, CD14和MARCO。msl1基因，一種已知的白血病干細(xì)胞增殖抑制因子，也在committed cluster中高表達(dá)。我們通過qPCR驗證了關(guān)鍵基因的差異表達(dá)(圖2B)。使用基因集合富集分析(GSEA)，在committed 亞型中，免疫反應(yīng)通路如干擾素- γ介導(dǎo)的信號通路、GPCR信號通路和toll樣受體(TLR)信號通路上調(diào)(圖2C, D, Supplementary Figs. 16, 18，與FLT3-ITD和DNMT3A突變的弱相關(guān)性一致。
三、原始表型和染色質(zhì)可及性
雖然基因表達(dá)反映了細(xì)胞身份的活躍狀態(tài)，但順式調(diào)節(jié)元件(cre)，包括啟動子和增強(qiáng)子，是決定細(xì)胞命運(yùn)的潛在因素。因此，我們研究了npm1突變的AML樣本是否也會根據(jù)其順式調(diào)控景觀分層為原始和committed的集群。使用轉(zhuǎn)座酶可達(dá)染色質(zhì)測序(ATAC-seq)可達(dá)染色質(zhì)區(qū)域，以CREAM方法鑒定的核心為重點，根據(jù)表達(dá)譜對AML樣本進(jìn)行聚類，但有一個例外(圖3A)。我們的研究結(jié)果表明，啟動子區(qū)形成了核心(啟動子:FDR = 11%，基因間:FDR = 2%;圖3B、C及補(bǔ)充圖19)。RUNX和GATA家族成員HOXC9和CTCF的dna結(jié)合位點基模只富集在原始亞型的COREs中，提示可能存在調(diào)控原始亞型基因的因素(圖3D，補(bǔ)充數(shù)據(jù)3).對承諾亞型中唯一可獲得的核心進(jìn)行基序富集分析，確定了CEBP、ATF家族成員、OCT2、IRF2、NFkB-p65、ESRRB和EGR2識別的共識序列，提示它們在committed亞型中可能發(fā)揮的作用(圖3D)補(bǔ)充數(shù)據(jù)。
我們采用質(zhì)譜耦合流式細(xì)胞儀(CyTOF)分析，在單細(xì)胞水平上探討9例原始AML npm1突變和8例committed npm1突變的患者的免疫表型差異。我們使用細(xì)胞術(shù)(diffcyt)27管道來計算定義具有相似高維表型的細(xì)胞群(免疫表型簇)。每個免疫表型聚類映射到二維t-隨機(jī)近鄰嵌入(t-SNE)圖上的離散區(qū)域(圖4A;補(bǔ)充圖20、21)，證實它們表達(dá)不同的免疫表型。分析顯示，七種不同水平的CD45和造血祖細(xì)胞標(biāo)記物(CD34, CD38)或骨髓單核細(xì)胞分化標(biāo)記物(CD33, CD14, CD11c, CD16, HLA-DR)的惡性免疫表型集群在這兩種亞型之間差異豐富(圖4B，C)。確診病例中也包含較高豐度的非白血病免疫表型集群，包括CD45hi T (CD3+)、B (CD19+)和NK (CD3 CD56+ CD16+)細(xì)胞(補(bǔ)充圖20)。
npm1突變的AML原始病例中，免疫表型集群3和8的豐度明顯較高，這些集群3和8表型原始，由表達(dá)低水平的骨髓單核細(xì)胞分化標(biāo)志物的CD34+ CD38lo(3)或CD34 CD38lo(8)細(xì)胞組成(圖4C, D，補(bǔ)充圖21)。非顯著白血病集群為CD34，但表達(dá)少量的骨髓單核細(xì)胞標(biāo)記物。相比之下,npm1突變的急性髓細(xì)胞白血病committed 病例顯示出5個免疫表型集群(1,7,16,22和24)的豐度高于原始病例(圖4B, D)。這些免疫表型集群包括CD34?/lo CD38+ CD11c+細(xì)胞也表達(dá)CD33、CD14、CD16和HLA-DR的各種組合，顯示出異常的骨髓單核細(xì)胞分化(圖4C，補(bǔ)充圖21A)。在原始病例中，顯著原始免疫表型聚集的總豐度較低(平均值(9.4±11.4%)，顯著分化免疫表型聚集(平均53±37%)。
評估了原始亞型和committed亞型是否與患者總生存期相關(guān)(圖5A;補(bǔ)充圖22)。與committed亞型相比，原始亞型與明顯更差的生存率相關(guān)(Log-rank檢驗p = 0.002)。為了確定我們的聚類是否超出了已建立的預(yù)測因素，我們還擬合了一個多變量Cox比例風(fēng)險模型，調(diào)整了臨床病理參數(shù)，如性別、白細(xì)胞計數(shù)、年齡、核型和突變，包括FLT3- itd、FLT3- TKD、DNMT3A、NRAS和KRAS。多變量分析顯示，原始亞型和committed亞型具有顯著的互補(bǔ)預(yù)后價值(p-值= 0.01，圖5B)。
六、原始亞型預(yù)示著對激酶抑制劑的敏感性增加
生成各化合物的藥物劑量響應(yīng)曲線，并比較各亞型間曲線下面積(area under the curve, AUCd)(單個藥物劑量響應(yīng)曲線見圖6、)。體外藥物篩選顯示，原始聚類患者樣本對索拉非尼、舒尼替尼和魯索利替尼的敏感性高于合并亞型(Wilcoxon秩和檢驗p-value分別= 2E 5、0.02和0.01;在UHN患者樣本中，Quizartinib的亞型間差異反應(yīng)較弱，而伊馬替尼和達(dá)沙替尼的亞型間無差異(補(bǔ)充圖27)。
使用BeatAML33數(shù)據(jù)集，驗證原始和committed亞型對激酶抑制劑的反應(yīng)之間的聯(lián)系，該數(shù)據(jù)集包含npm1突變AML患者樣本的體外藥物篩選。我們觀察到UHN和BeatAML數(shù)據(jù)集之間的良好一致性，原始聚類中的樣本對Sorafenib和Sunitinib表現(xiàn)出更高的敏感性(圖6)。有趣的是，Quizartinib在UHN隊列中有微弱的差異反應(yīng)，但在BeatAML隊列中卻有統(tǒng)計學(xué)意義的差異。