IFN暴露誘導(dǎo)的CD8 + T細(xì)胞線粒體異常加速系統(tǒng)性紅斑狼瘡病發(fā)

系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)患者大多數(shù)存在I型IFN刺激基因(ISGs)的高表達(dá)。線粒體異常也有報(bào)道，但I型IFN暴露對這些變化的貢獻(xiàn)尚不清楚。此外，I型IFN通過上調(diào)脂肪酸氧化(FAO)和氧化磷酸化(OXPHOS)促進(jìn)漿細(xì)胞樣樹突狀細(xì)胞（pDCs）的線粒體功能。本文數(shù)據(jù)表明，I型IFN暴露通過代謝重編程促進(jìn)CD8 + T細(xì)胞死亡，有助于SLE發(fā)病。本文于2021年3月發(fā)表在《Nature Communications》IF:12.121。

技術(shù)路線如下：

主要實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下：

1、ISGs高表達(dá)患者OXPHOS基因下調(diào)

為了確定是否T細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄組特征可以幫助鑒定SLE患者的疾病活動(dòng)，作者對來源于激活和未激活女性的CD8⁺ T和CD4⁺ T細(xì)胞的mRNA進(jìn)行測序。對DEGs進(jìn)行聚類熱圖分析，發(fā)現(xiàn)SLE患者根據(jù)ISG表達(dá)水平被分為顯著的兩類：SLE-1和SLE-2（Fig. 1a, b）。在兩種T細(xì)胞中，SLE-2類群的患者具有更強(qiáng)烈的I型IFN特征。在CD4⁺ T細(xì)胞中，這種特征伴隨著參與JAK-STAT信號和T細(xì)胞共刺激的基因，而在CD8⁺ T細(xì)胞中，ISG基因的高表達(dá)與基因參與細(xì)胞周期，響應(yīng)DNA損傷和凋亡有關(guān)（Fig. 1a, b）。比較SLE-1和SLE-2組的轉(zhuǎn)錄表達(dá)譜，結(jié)果顯示，除ISGs外，mtDNA編碼的OXPHOS基因的表達(dá)差異最大（Fig. 1c, d）?？傊?/span>SLE患者純化T細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析根據(jù)ISG表達(dá)水平將其分為兩組，表達(dá)高I型IFN標(biāo)記的患者顯示線粒體編碼基因和線粒體相關(guān)代謝途徑的表達(dá)減少，在CD8 + T細(xì)胞中更明顯。這表明SLE中與I型IFN相關(guān)的線粒體功能失調(diào)。

圖1健康志愿者和SLE患者CD8⁺ T和CD4⁺ T細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析

2、ISGs高表達(dá)患者CD8+ T細(xì)胞線粒體異常

在研究I型IFN信號與線粒體異常之間的潛在聯(lián)系之前，應(yīng)用計(jì)算機(jī)模擬和體外相結(jié)合的方法，根據(jù)I型IFN信號的強(qiáng)弱程度對SLE患者進(jìn)行分層：高水平的ISGs(IFN-high)、低水平的ISGs(IFN-low)和無ISGs(IFN-Neg)。隨后，探究IFN-high和IFN-Neg的SLE患者中T細(xì)胞的線粒體基因型，以類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎（RA）患者為疾病對照。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與健康組，IFN-Neg組和RA組相比，來源于IFN-high的SLE患者的CD8⁺ T細(xì)胞表現(xiàn)出線粒體大小增加（圖2a,b）和線粒體膜超極化（圖2c）。在IFN-High的SLE患者中，也觀察到細(xì)胞ROS (cROS)陽性CD8+ T細(xì)胞比例增加，但只是線粒體ROS (mROS)染色細(xì)胞比例有上升趨勢（圖2d）。在IFN -Neg的SLE患者中也檢測到更高比例cROS陽性細(xì)胞，這表明了一種疾病特異性效應(yīng)（圖2d）。

顯微圖像補(bǔ)充了流式細(xì)胞術(shù)數(shù)據(jù)，顯示在來IFN-High的SLE的CD8+ T細(xì)胞中，線粒體在形態(tài)上與IFN -Neg的SLE患者不同，在IFN-High CD8+ T細(xì)胞中，每個(gè)細(xì)胞的平均線粒體總體積更大(圖2e)。綜上所述，這些數(shù)據(jù)表明，在SLE患者中，長期暴露IFNα可能會(huì)觸發(fā)CD8+細(xì)胞的線粒體變化，但不會(huì)觸發(fā)CD4+和T細(xì)胞的線粒體變化，這可能導(dǎo)致代謝紊亂的細(xì)胞，對其功能具有潛在的影響。

圖2 SLE患者總CD8⁺ T細(xì)胞的線粒體變化

3、來自IFN-High的SLE患者的CD8+ T細(xì)胞的SRC減少

接下來比較了從SLE患者和HC外周血分選的離體CD4 + 和CD8 + T細(xì)胞的線粒體呼吸和有氧糖酵解。使用Seahorse細(xì)胞外通量分析儀，發(fā)現(xiàn)IFN-Neg患者的CD8 + T細(xì)胞具有與HC相似的基礎(chǔ)和最大耗氧量率(OCR)，而IFN-High患者的CD8 + T細(xì)胞表現(xiàn)出較少的基礎(chǔ)和最大OCR（圖3a）。重要的是，在IFN-High CD8 + T細(xì)胞中，備用呼吸能力(SRC)，反映細(xì)胞適應(yīng)能量需求增加的能力，顯著降低（圖3a）。SRC的降低伴隨著細(xì)胞內(nèi)ATP水平的一些降低（附圖9a）。另一方面，從相同患者中同時(shí)分離的CD4 + T細(xì)胞中未檢測到OCR或SRC的顯著異常（圖3a）。接下來探索在IFN-High患者的CD8 + T細(xì)胞離體觀察到的代謝異常是否會(huì)導(dǎo)致T細(xì)胞缺陷。與健康對照和IFN-Neg SLE患者相比，IFN-High SLE患者的CD8 + T細(xì)胞自發(fā)死亡增加（圖3b）?？偟膩碚f，數(shù)據(jù)表明，I型IFN通路的持續(xù)激活可能會(huì)降低CD8 + T細(xì)胞的代謝適合性，從而降低其存活能力。

圖3 SLE患者CD8⁺T細(xì)胞的代謝分析和凋亡率

4、TCR和IFN信號共同誘導(dǎo)CD8+ T細(xì)胞代謝重組

為了研究導(dǎo)致IFN-High CD8 ⁺ T細(xì)胞線粒體和代謝變化的連續(xù)事件，接下來使用來源于健康對照和結(jié)合了延長IFN處理和TCR活化（這是SLE患者中存在的兩種基本細(xì)胞信號）的細(xì)胞。盡管CD8 + T細(xì)胞暴露于IFNα 里2天不會(huì)引發(fā)任何顯著的線粒體或代謝變化但7天IFNα暴露，尤其是結(jié)合T細(xì)胞活化，可誘導(dǎo)mtDNA編碼基因表達(dá)下調(diào)（圖4a）和線粒體變化（圖4b）。然后，分析了CD8 + T細(xì)胞的氧化能力，發(fā)現(xiàn)在有或沒有CD3/CD28活化的情況下，7天IFNα刺激顯著增強(qiáng)了基礎(chǔ)OCR，但沒有最大OCR，當(dāng)數(shù)值標(biāo)準(zhǔn)化到每個(gè)樣本的基礎(chǔ)水平時(shí)，導(dǎo)致SRC降低，尤其是當(dāng)IFNα暴露與T細(xì)胞活化結(jié)合時(shí)（圖4c）。

IFNα和抗CD3/CD28磁珠長期刺激后CD8 + T細(xì)胞中SRC能力的降低表明生物能量適應(yīng)性受損。研究發(fā)現(xiàn)，IFNα刺激的CD8 + T細(xì)胞在初始爆發(fā)后，與僅用CD3/CD28刺激的CD8 + T細(xì)胞相比，其氧化和糖酵解能力下降更快（圖4d）?？傊?，使用健康對照CD8 ⁺ T細(xì)胞的體外研究表明，雖然單獨(dú)延長IFNα處理能夠觸發(fā)可檢測的代謝改變，但只有IFNα暴露和T細(xì)胞活化的聯(lián)合才能表型復(fù)制IFN-High SLE患者CD8 + T細(xì)胞中觀察到的線粒體和代謝異常。

圖4. 7天內(nèi)IFNα暴露和T細(xì)胞活化引發(fā)的代謝變化

5、IFNα暴露誘導(dǎo)慢性激活CD8+ T細(xì)胞死亡

在建立重現(xiàn)SLE CD8 + T細(xì)胞代謝變化的實(shí)驗(yàn)條件后，接下來研究了下游效應(yīng)。與SLE患者的離體數(shù)據(jù)一致，發(fā)現(xiàn)IFNα暴露延長聯(lián)合T細(xì)胞活化可促進(jìn)CD8 + T細(xì)胞的自發(fā)死亡（圖5a）。與自發(fā)性細(xì)胞死亡數(shù)據(jù)一致，作者發(fā)現(xiàn)再激發(fā)后，暴露于IFNα的細(xì)胞中表達(dá)Annexin V的增殖性CD8 + T細(xì)胞百分比顯著增加（圖5b）。此外，在IFN刺激的細(xì)胞中檢測到較少的脫顆粒（CD107a陽性）和活化的（CD69和CD25陽性）CD8 + T細(xì)胞（圖5c）?？傊?，數(shù)據(jù)表明，I型IFN改變了SLE患者CD8⁺ T細(xì)胞的代謝，導(dǎo)致TCR再激發(fā)后細(xì)胞存活率降低。

圖5. IFNα暴露7天誘導(dǎo)T細(xì)胞活化的變化

6、IFNα暴露增加CD8⁺ T細(xì)胞的NAD+的消耗

為了了解慢性I型IFN與CD8 + T細(xì)胞下游線粒體和代謝變化之間的機(jī)制聯(lián)系，首先在SLE患者CD8 + T細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄組學(xué)數(shù)據(jù)中探索了哪些通路與I型IFN信號相關(guān)。結(jié)果顯示煙酸/煙酰胺代謝途徑顯示出最高的相關(guān)性（圖6a），并且在IFN-high SLE患者的CD8 + T細(xì)胞中，NAD消耗酶，如ADP-核糖聚合酶（PARP9、PARP10和PARP12）和CD3828顯著上調(diào)（圖6b）。觀察到延長IFNα和TCR刺激后CD8⁺T細(xì)胞中NAD +/NADH比值顯著降低（圖6d），該實(shí)驗(yàn)條件模擬了在IFN-high的SLE患者CD8 + T細(xì)胞中觀察到的線粒體和代謝異常，表明在活化的CD8 + T細(xì)胞中，I型IFN信號引起的NAD消耗酶表達(dá)上調(diào)可導(dǎo)致NAD + 耗竭和隨后的線粒體功能障礙。

為了檢測補(bǔ)充NAD ⁺ 是否可以糾正IFNα刺激的下游效應(yīng)，用1 mM β-煙酰胺單核苷酸(NMN)培養(yǎng)CD8 + T細(xì)胞以恢復(fù)NAD +/NADH比值（圖6e）。然后，評估了用抗CD3/CD28再刺激后的氧化反應(yīng)和細(xì)胞活力。補(bǔ)充NMN的NAD + 增加了OCR（圖6f），但未增加ECAR，表明線粒體能力增加。重要的是，通過NMN處理恢復(fù)NAD + 的可用性改善了IFNα延長和TCR刺激后的細(xì)胞活力（圖6 g），表明NAD途徑調(diào)節(jié)這些活化的人CD8 + T細(xì)胞中的線粒體適應(yīng)性和細(xì)胞存活率?？傊?，這些數(shù)據(jù)表明，在人TCR刺激的CD8 + T細(xì)胞中，延長IFNα暴露增加了NAD + 的消耗，并降低了NAD +/NADH比值。這導(dǎo)致再刺激后線粒體呼吸缺陷和細(xì)胞活力降低。NAD + 前體NMN糾正了這些代謝變化，提高了CD8 + T細(xì)胞活力。

圖6. IFNα增加NAD+消耗導(dǎo)致SCR降低和細(xì)胞活力

本文在一組臨床定義明確的SLE伴活檢證實(shí)的腎炎患者中進(jìn)行的T細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組學(xué)和代謝研究表明，高IFN信號可驅(qū)動(dòng)CD8 + T細(xì)胞線粒體代謝途徑的變化，使其生物能量不適應(yīng)且更容易死亡。本文證明在SLE患者的CD8 + T細(xì)胞中觀察到的代謝重編程是延長IFNα暴露和TCR刺激的結(jié)果。在這兩種刺激的持續(xù)組合下，這可能是SLE患者特有的一種情況，CD8 + T細(xì)胞表現(xiàn)出與NAD + 消耗增強(qiáng)、線粒體氧化能力降低和存活率下降相關(guān)的PARP基因表達(dá)增加（圖7)。總的來說，本文的發(fā)現(xiàn)證明高ISG特征與SLE CD8 + T細(xì)胞的代謝適合性之間的聯(lián)系，以及它們在壓力下或?qū)乖偌ぐl(fā)的反應(yīng)中存活的能力。

圖7. I型干擾素調(diào)節(jié)SLE患者CD8⁺T細(xì)胞的代謝適合度

參考文獻(xiàn)：

Buang Norzawani., Tapeng Lunnathaya., Gray Victor., Sardini Alessandro., Whilding Chad., Lightstone Liz., Cairns Thomas D., Pickering Matthew C., Behmoaras Jacques., Ling Guang Sheng., Botto Marina.(2021). Type I interferons affect the metabolic fitness of CD8 T cells from patients with systemic lupus erythematosus. Nat Commun, 12(1), 1980. doi:10.1038/s41467-021-22312-y