M1極化巨噬細(xì)胞的外泌體miR-155與脊髓損傷

病理上，脊髓損傷(SCI)后血脊髓屏障(BSCB)破裂導(dǎo)致大量周圍巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)到損傷區(qū)域，并在新生血管周圍聚集。M1極化的巨噬細(xì)胞在SCI過(guò)程中起著至關(guān)重要的作用。今天小編給大家介紹于2020年3月發(fā)表在影響因子為9.986的“Redox Biology”上的文章“Exosomal miR-155 from M1-polarized macrophages promotes EndoMT and impairs mitochondrial function via activating NF-κB signaling pathway in vascular endothelial cells after traumatic spinal cord injury”。本研究旨在探討M1極化的骨髓源性巨噬細(xì)胞(M1-BMDMs)對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞的影響及其機(jī)制。在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)SCI后巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)可通過(guò)傳遞外泌體miR-155促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)內(nèi)膜結(jié)構(gòu)和損害線粒體功能，從而加重BSCB完整性破壞，miR-155隨后通過(guò)抑制SOCS6誘導(dǎo)的p65降解，激活NF-κB通路。

技術(shù)路線

結(jié)果

1）脊髓損傷后，BSCB隨著巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)和TJs破壞而破壞

脊髓損傷后，BSCB的完整性被破壞，如圖1A和B所示，在脊髓損傷中可見(jiàn)EB染色明顯，而假手術(shù)組未見(jiàn)EB染色，脊髓中EB染色含量也明顯增加。此外，在BSCB破壞的同時(shí)，我們發(fā)現(xiàn)大量巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)損傷區(qū)血管周圍(圖1C)，以M1極化為主，表現(xiàn)為CD68+和iNOS+(圖1C，1D)。此外，脊髓損傷后的病變區(qū)域可見(jiàn)明顯的血管新生，這可能是缺氧微環(huán)境所致；然而，TJs和血管的熒光染色顯示，與非損傷區(qū)相比，損傷區(qū)ZO-1和Occludin與CD31的共位較少(圖1E和F)。脊髓損傷后TJs蛋白水平隨時(shí)間顯著降低(圖1G)?？紤]到脊髓損傷后浸潤(rùn)的M1極化巨噬細(xì)胞與病變區(qū)域的血管存在相互干擾，我們推測(cè)M1極化巨噬細(xì)胞可能對(duì)脊髓損傷后的血管內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)揮重要作用，損害BSCB的完整性。

2）M1-BMDMs來(lái)源的外泌體加重了bEnd.3 細(xì)胞的EndoMT

我們?cè)u(píng)估了M1-BMDMs對(duì)bEnd.3細(xì)胞的影響。結(jié)果表明，M1-BMDMs條件培養(yǎng)基(M1-CM)顯著降低了bEnd.3 細(xì)胞TEER值(圖2A)，并增加通透性(圖2B)。此外，TJs蛋白熒光染色顯示，M1-CM處理顯著降低了bEnd.3 細(xì)胞膜ZO-1和Occludin的表達(dá)(圖2C和D)。為了進(jìn)一步研究M1- BMDMs是否通過(guò)外泌體破壞血管內(nèi)皮細(xì)胞的TJs，我們使用外泌體分泌抑制劑GW4869預(yù)處理M1- BMDMs。我們發(fā)現(xiàn)，加入GW4869部分逆轉(zhuǎn)了M1-CM誘導(dǎo)的TEER值的下降(圖2A)，滲透率增加(圖2B)；GW4869也逆轉(zhuǎn)了TJs蛋白熒光強(qiáng)度下降的趨勢(shì)(圖2C和D)。相應(yīng)的，TJs蛋白表達(dá)水平也出現(xiàn)了類似的結(jié)果(圖2E)。有趣的是，通過(guò)對(duì)脊髓切片中的α-SMA和CD31進(jìn)行共染色，我們發(fā)現(xiàn)損傷部位的共定位比未損傷部位更多(圖2F和G)。M1-CM顯著改變bEnd.3 細(xì)胞形態(tài)，分枝減少，胞體拉長(zhǎng)(圖2H)。此外，M1-CM暴露顯著降低了CD31的表達(dá)，并強(qiáng)烈增強(qiáng)了EndoMT標(biāo)記物膠原I、III和α-SMA在bEnd.3 細(xì)胞中的表達(dá)(圖2I)。然而，GW4869可以部分扭轉(zhuǎn)這些影響。綜上所述，外泌體可能介導(dǎo)巨噬細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞之間的相互作用，并可能是巨噬細(xì)胞誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞 EndoMT的原因。

3）M1-BMDMs來(lái)源的外泌體上調(diào)ROS水平，損害bEnd.3 細(xì)胞的線粒體功能

已有研究表明，ROS與BSCB中斷有關(guān)，調(diào)節(jié)ROS水平在促進(jìn)中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷后功能恢復(fù)中起著至關(guān)重要的作用?；谥暗慕Y(jié)果，我們研究了M1-BMDMs和ROS在bEnd.3 細(xì)胞中的關(guān)系。流式細(xì)胞術(shù)分析表明，M1-CM處理可顯著提高bEnd.3 細(xì)胞中ROS水平。GW4869可以部分逆轉(zhuǎn)這種增加(圖3 A和B)。此外，與M1-CM孵育后，線粒體超氧化物水平顯著升高，GW4869部分消除線粒體超氧化物水平(圖3C和D)。如圖JC-1染色所示，加入M1-CM后線粒體電位顯著降低，GW4869部分恢復(fù)線粒體電位(圖3E和F)。M1-CM處理使線粒體長(zhǎng)度縮短、腫脹，線粒體破碎的細(xì)胞比例明顯增加。然而，GW4869可以部分逆轉(zhuǎn)線粒體形態(tài)變化(圖3G和H)。此外，M1-CM暴露顯著降低了氧化磷酸化的生物標(biāo)志物OCR(圖3I)。基礎(chǔ)呼吸，ATP產(chǎn)生，呼吸能力，呼吸逆轉(zhuǎn)在添加M1-CM后顯著減少，而GW4869部分緩解了這一影響(圖3J)。

4）M1-BMDMs來(lái)源的外泌體在體內(nèi)阻礙脊髓損傷后的運(yùn)動(dòng)功能恢復(fù)和破壞BSCB

為了進(jìn)一步研究巨噬細(xì)胞在SCI微環(huán)境中的作用及其對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞的潛在影響，我們提取并鑒定了來(lái)自M1-BMDMs (M1-Exos)的外泌體。脊髓損傷后立即注射外泌體，在指定時(shí)間進(jìn)行一系列行為評(píng)估(圖4A)。BMS行為分析表明，M1-Exos注射可導(dǎo)致脊髓損傷后后肢運(yùn)動(dòng)功能評(píng)分降低(圖4B)。足跡分析、電生理測(cè)試和游泳測(cè)試顯示了類似的結(jié)果，M1-Exos處理導(dǎo)致更短的步幅(圖4C)，更低的MEPs振幅(圖4D)，更傾斜的身體角度，更下垂的尾巴(圖4E)。EB外滲實(shí)驗(yàn)顯示，M1-Exos處理組有更多EB染料滲漏到間隙中(圖4F)， TEM下血管TJs的電子密度遠(yuǎn)低于PBS組，兩內(nèi)皮細(xì)胞之間的間隙也更明顯(圖4G)。此外，注射M1-Exos后，脊髓病變中血管ZO-1的熒光強(qiáng)度顯著減弱(圖4H)；TJs蛋白表達(dá)水平也明顯下調(diào)(圖4I)。我們還發(fā)現(xiàn)，M1-Exos給藥后，病變區(qū)域更多的α-SMA與CD31共存(圖4J)；I型膠原、III型膠原和α-SMA蛋白水平上調(diào)，CD31表達(dá)降低(圖4K)。以上結(jié)果表明，M1- Exos可能誘發(fā)EndoMT加重脊髓損傷后BSCB的損傷，阻礙運(yùn)動(dòng)功能恢復(fù)。

5）M1-Exos通過(guò)傳遞miR-155加重了EndoMT

為了研究外泌體miR-155在SCI后M1-Exos介導(dǎo)的BSCB破壞惡化中的作用，構(gòu)建miR-155過(guò)表達(dá)(miR-155^OE)和敲低(miR-155^KD) BMDMs，然后分離外泌體并處理bEnd.3細(xì)胞。如圖5A和B所示，miR-155^OE-Exos組TEER值顯著降低，通透性顯著增加，而miR-155^KD-Exos組則相反。加入miR-155^OE-Exos后，ZO-1和Occludin的熒光強(qiáng)度明顯降低，而miR-155^KD-Exos處理后，ZO-1和Occludin的表達(dá)顯著增強(qiáng)(圖5C和D)。此外，western blot檢測(cè)TJs蛋白的表達(dá)，結(jié)果與上述討論的結(jié)果相似(圖5E)。miR-155^OE-Exos可促進(jìn)細(xì)胞形態(tài)轉(zhuǎn)化，其分支更少，體細(xì)胞更長(zhǎng)。miR-155^KD-Exos處理后的結(jié)果則相反(圖5F)。miR-155^OE-Exos暴露后，I型膠原蛋白、III型膠原蛋白和α-SMA蛋白水平上調(diào)，CD31蛋白水平下調(diào)，而miR-155^KD-Exos作用相反(圖5G)。以上結(jié)果表明，外泌體miR-155在促進(jìn)bEnd.3細(xì)胞的EndoMT中起著至關(guān)重要的作用。

6）M1-Exos通過(guò)傳遞miR-155上調(diào)ROS水平，損害bEnd.3細(xì)胞線粒體功能

我們研究了外泌體miR-155與bEnd.3細(xì)胞中線粒體功能的關(guān)系。我們發(fā)現(xiàn)，與miR-NC^OE-Exos相比，miR-155^OE-Exos處理上調(diào)了ROS水平(圖6A和B)，線粒體超氧化物水平(圖6C和D)和線粒體電位(圖6E)；然而，miR-155^KD-Exos處理則顯示了相反的結(jié)果(圖6A-E)。此外，miR-155^OE-Exos可使線粒體腫脹更大，形態(tài)更短，線粒體碎片細(xì)胞比例更高，而miR-155^KD-Exos可減輕線粒體腫脹(圖6F和G)。miR-155^OE-Exos處理后的OCR、基礎(chǔ)呼吸、ATP產(chǎn)生、呼吸能力和呼吸逆轉(zhuǎn)均明顯下降，而miR-155^KD-Exos處理減輕了氧化呼吸功能障礙(圖6H和I)。這些結(jié)果表明，上調(diào)外泌體miR-155可導(dǎo)致過(guò)度ROS的產(chǎn)生和線粒體功能障礙。

7）miR-155負(fù)調(diào)控SOCS6表達(dá)，激活NF-κB通路

為了進(jìn)一步探討外泌體miR-155誘導(dǎo)EndoMT和線粒體功能障礙的潛在機(jī)制，我們重點(diǎn)研究了miR-155的下游基因。首先，利用在線miRNA靶標(biāo)數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)了84個(gè)潛在靶基因。SOCS6是具有3’UTR的下游mRNA之一，可能與miR-155結(jié)合(圖7A)。結(jié)合GSE49329和GSE49330數(shù)據(jù)庫(kù)，我們發(fā)現(xiàn)miR-155的表達(dá)與SOCS6的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)(圖7B)。為了進(jìn)一步證實(shí)SOCS6 3’UTR是miR-155的直接靶標(biāo)，我們根據(jù)預(yù)測(cè)的結(jié)合位點(diǎn)(圖7C)構(gòu)建了SOCS6 3’UTR野生型(WT)和突變型(MUT)序列。熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)顯示，與對(duì)照組相比，共轉(zhuǎn)染SOCS6的WT-3’UTR時(shí)，miR-155過(guò)表達(dá)明顯降低了熒光素酶活性(圖7D)。qRT-PCR和western blot進(jìn)一步顯示，miR-155過(guò)表達(dá)導(dǎo)致SOCS6表達(dá)降低，而miR-155敲低上調(diào)SOCS6 mRNA和蛋白水平(圖7E和F)。GO分析顯示miR-155可以負(fù)向調(diào)控細(xì)胞-細(xì)胞粘附，參與調(diào)控成纖維細(xì)胞增殖(圖7G)。從GO分析可知，miR-155可能介導(dǎo)NF-κB信號(hào)通路(圖7G)。過(guò)表達(dá)miR-155可顯著提高細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中p65蛋白的水平，而敲低miR-155可起到相反的作用(圖7H)。

8）SOCS6通過(guò)泛素化和降解p65抑制NF-κB信號(hào)通路

鑒于miR-155通過(guò)增強(qiáng)細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中p65的表達(dá)負(fù)調(diào)控SOCS6的表達(dá)，并激活NF-κB信號(hào)通路，我們下一步研究SOCS6與p65之間潛在的相互作用。首先，我們?cè)?/span>bEnd.3細(xì)胞中過(guò)表達(dá)或下調(diào)SOCS6。發(fā)現(xiàn)p65表達(dá)與SOCS6水平呈負(fù)相關(guān)(圖8A)。Discovery Studio?分析的3D對(duì)接也表明SOCS6可能與p65相互作用(圖8B)。此外，熒光共定位實(shí)驗(yàn)表明，SOCS6與p65在細(xì)胞質(zhì)中共定位(圖8C和D)， Co-IP實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步揭示了SOCS6與p65的相互作用(圖8E)。值得注意的是蛋白酶體MG132可以部分逆轉(zhuǎn)SOCS6過(guò)表達(dá)對(duì)p65蛋白水平的抑制作用(圖8F)。同時(shí)，在環(huán)己酰亞胺的情況下，SOCS6的沉默顯著延緩了內(nèi)源性p65的降解速率，而過(guò)表達(dá)SOCS6則顯著加速了p65的降解(圖8G)。最后，通過(guò)泛素化實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證SOCS6是否通過(guò)蛋白酶體降解誘導(dǎo)p65失穩(wěn)。我們發(fā)現(xiàn)過(guò)表達(dá)SOCS6增加了bEnd.3細(xì)胞中p65多聚泛素化。沉默SOCS6則相反(圖8H)。綜上所述，這些結(jié)果表明SOCS6可以與p65結(jié)合并誘導(dǎo)其多聚泛素化和蛋白酶體降解。

9）M1-Exos通過(guò)miR-155/ SOCS6/p65軸加重了bEnd.3細(xì)胞的EndoMT

為了探討外泌體miR-155/SOCS6/p65軸在M1-Exos誘導(dǎo)的EndoMT中的作用，我們?cè)隗w外進(jìn)行了一系列功能喪失和功能獲得實(shí)驗(yàn)。我們發(fā)現(xiàn)，SOCS6過(guò)表達(dá)部分逆轉(zhuǎn)了miR-NC^OE-Exos或miR-155^OE-Exos誘導(dǎo)的TEER值降低和通透性增加(圖9A和B)。ZO-1和Occludin的熒光強(qiáng)度進(jìn)一步顯示SOCS6過(guò)表達(dá)顯著逆轉(zhuǎn)了miR-NC^OE-Exos或miR-155^OE-Exos在bEnd.3細(xì)胞中引起的TJs破壞(圖9C)。此外，EndoMT標(biāo)記物的蛋白水平與這些結(jié)果一致，SOCS6上調(diào)可消除miR-NC^OE-Exos或miR-155^OE-Exos介導(dǎo)的p65上調(diào)(圖9D)。值得注意的是，當(dāng)miR-NC^KD-Exos或miR-155^KD-Exos下調(diào)SOCS6時(shí)，則出現(xiàn)相反的結(jié)果(圖9E-H)。

 10）M1-Exos在bEnd.3細(xì)胞中通過(guò)miR-155/SOCS6/p65軸上調(diào)ROS水平，損害線粒體功能

我們進(jìn)行了一系列功能喪失和功能獲得實(shí)驗(yàn)來(lái)研究miR-155/SOCS6/p65軸在調(diào)節(jié)線粒體功能中的作用。如圖10A -E所示，SOCS6過(guò)表達(dá)消除了miR-NC^OE-Exos或miR-155^OE-Exos誘導(dǎo)的ROS水平(圖10A和B)、線粒體超氧化物含量(圖10C和D)和線粒體電位(圖10E)的升高。此外，SOCS6過(guò)表達(dá)顯著緩解了miR-NC^OE-Exos或miR-155^OE-Exos處理后的線粒體腫脹，并降低了線粒體碎片細(xì)胞的比例(圖10F和G)。進(jìn)一步的結(jié)果表明，SOCS6過(guò)表達(dá)可挽救miR-NC^OE-Exos或miR-155^OE-Exos處理導(dǎo)致的OCR、基礎(chǔ)呼吸、ATP產(chǎn)生、呼吸能力和呼吸逆轉(zhuǎn)的下降(圖10H和I)。miR- NC^KD-Exos或miR-155^KD-Exos處理后沉默SOCS6則出現(xiàn)相反的結(jié)果(圖10J-R)。

結(jié)論：在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)SCI后浸潤(rùn)的巨噬細(xì)胞可通過(guò)傳遞外泌體miR-155促進(jìn)EndoMT，損害線粒體功能，從而加重BSCB完整性，隨后通過(guò)抑制SOCS6誘導(dǎo)的p65降解，激活NF-κB通路。我們的工作可能會(huì)加強(qiáng)對(duì)巨噬細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞之間相互干擾的理解，并揭示脊髓損傷后BSCB完整性的潛在調(diào)節(jié)機(jī)制。