TEA-seq——同時測定轉(zhuǎn)錄本、表位和染色質(zhì)可及性的三峰式單細(xì)胞的新工具
2021年，美國華盛頓大學(xué)生物醫(yī)學(xué)信息學(xué)與醫(yī)學(xué)教育系和華盛頓大學(xué)兒科等團(tuán)隊合作在Elife（IF=7.08） 雜志上發(fā)表了文章“Simultaneous trimodal single-cell measurement of transcripts, epitopes, and chromatin accessibility using TEA-seq.”。此報道開發(fā)了一種新的scATAC-seq工作流程，增加了信噪比，并允許對細(xì)胞表面標(biāo)記物和染色質(zhì)可及性進(jìn)行配對測量:染色質(zhì)環(huán)境和表位的整合細(xì)胞索引，稱為ICICLE-seq。用基于液滴的多組學(xué)平臺擴(kuò)展了這種方法，開發(fā)了一種三峰分析方法，可以同時測量數(shù)千個單細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄組學(xué)(scRNA-seq)、表位和染色質(zhì)可及性(scATAC-seq)，并稱之為TEA-seq。這些多模式單細(xì)胞檢測提供了一個新的工具箱來識別基于表型定義的細(xì)胞類型的類型特異性基因調(diào)控和表達(dá)。
外周血單個核細(xì)胞(PBMCs)梯度離心純化是研究人體免疫健康和疾病的臨床相關(guān)細(xì)胞的主要來源。像大多數(shù)其他人體組織一樣，PBMC是一種復(fù)雜的、異構(gòu)的細(xì)胞類型混合物，來源于共同的干細(xì)胞祖細(xì)胞。盡管不同的PBMC細(xì)胞類型之間的基因組大部分是不變的，但每種免疫細(xì)胞類型執(zhí)行重要的和不同的功能。理解控制細(xì)胞系規(guī)范、細(xì)胞成熟、激活狀態(tài)和響應(yīng)細(xì)胞內(nèi)外信號的功能多樣性的基因組調(diào)控景觀，是理解健康和疾病中的免疫系統(tǒng)的關(guān)鍵。
最近單細(xì)胞基因組方法的改進(jìn)使復(fù)雜細(xì)胞類型混合物的調(diào)控染色質(zhì)景觀的輪廓成為可能。特別是，基于液滴的單核或單細(xì)胞轉(zhuǎn)座酶可及染色質(zhì)分析(snATAC-seq, scATAC-seq, dscATAC-seq, mtscATAC-seq)允許在單細(xì)胞分辨率下分析開放染色質(zhì)。有前景的新方法將scATAC-seq與同時測量核mRNA或與細(xì)胞表面表位結(jié)合。
然而，在單細(xì)胞方法中，尚未出現(xiàn)一種適用于所有三種模式的統(tǒng)一方法，這種方法可以應(yīng)用于高度特定的功能免疫細(xì)胞類型。我們系統(tǒng)地測試了PBMCs的全細(xì)胞和核純化和制備方法，以克服以往的分析只限于測量細(xì)胞表面的核成分(ATAC和核rna)或蛋白質(zhì)的局限性。我們發(fā)現(xiàn)完整的透性細(xì)胞的scATAC-seq表現(xiàn)非常好，在某些測量中超過了傳統(tǒng)的細(xì)胞核scATAC-seq(圖1b)。這一發(fā)現(xiàn)使得一種類似于轉(zhuǎn)錄組和表位的細(xì)胞索引(CITE-seq)的新方案能夠測量表面蛋白豐度和染色質(zhì)可及性:染色質(zhì)景觀和表位的整合細(xì)胞索引(ICICLE-seq，圖1a和3)。最后，我們證明了我們優(yōu)化的可滲透細(xì)胞方法可以與基于液滴的多組學(xué)平臺相結(jié)合，從而能夠同時測量細(xì)胞的三個不同的分子隔間:mRNA(通過scRNA-seq)，蛋白質(zhì)(使用寡聚標(biāo)記抗體)和DNA(通過scATAC-seq)，我們根據(jù)轉(zhuǎn)錄、表位和可及性將其稱為TEA-seq(圖4)。總之，對單細(xì)胞水平上基因調(diào)控和表達(dá)的分子基礎(chǔ)有了新的、更統(tǒng)一的看法。
一、PBMC單核、單細(xì)胞ATAC序列優(yōu)化
A. snATAC、scATAC和ICICLE-seq方法的主要步驟概要。ficoll純化的PBMCs和白細(xì)胞分離純化的PBMCs之間的一個主要區(qū)別是ficoll純化樣品中存在殘留的中性粒細(xì)胞。我們使用熒光激活細(xì)胞分選(FACS)從高中性粒細(xì)胞含量的PBMC樣本中檢測去除死細(xì)胞和碎片的方法，包括去除中性粒細(xì)胞和不去除中性粒細(xì)胞。
B. 這種單核分析利用低滲裂解、洗滌劑和皂苷的組合來分離細(xì)胞核，而不保留線粒體DNA。使用這種方法進(jìn)行snATAC-seq，測序，并將數(shù)據(jù)質(zhì)量指標(biāo)(材料和方法)制成表格后，鑒定了兩個主要的細(xì)胞條碼群體。細(xì)胞核制備的scATAC-seq文庫包含更多來自核小體DNA片段的reads，而來自細(xì)胞核的非細(xì)胞條形碼(灰線)包含的這些片段比細(xì)胞條形碼更多。
C. 為了評估這種差異對每種方法獲得的數(shù)據(jù)的影響，在TSS和CTCF轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)附近覆蓋了Tn5足跡。在透性細(xì)胞中，TSS的信號被保留，但是與孤立的核相比，TSS的側(cè)翼位置(被鄰近的核小體占據(jù))的信號減少了
D. 用白細(xì)胞分離純化的pbmc比用Ficoll梯度離心純化的pbmc始終具有更高的FRIP評分和更少的非細(xì)胞條形碼。
E. F. FACS獲得的完整通透細(xì)胞具有最高的frp和FRITSS評分，最少的非細(xì)胞條形碼和最大的細(xì)胞捕獲效率，線粒體閱讀量僅略有增加.
二、改進(jìn)標(biāo)簽轉(zhuǎn)移和差異分析
研究了方法差異對下游生物學(xué)分析的影響
A. B.去除中性粒細(xì)胞大大提高了在細(xì)胞核和細(xì)胞的均勻流形近似和投影(UMAP)投影中分離各種細(xì)胞類型的能力.
C使用這些工具，中性粒細(xì)胞的去除提高了標(biāo)記轉(zhuǎn)移評分，與核基方法相比，滲透性細(xì)胞產(chǎn)生了更多具有高標(biāo)記轉(zhuǎn)移評分的細(xì)胞.
D所有方法產(chǎn)生的CD16+單核細(xì)胞均少于流式細(xì)胞術(shù)觀察到的CD16+單核細(xì)胞，這表明無論是使用核或通透細(xì)胞的scATAC-seq過程中，CD16+單核細(xì)胞可能丟失，或者標(biāo)簽轉(zhuǎn)移方法不利于識別這種細(xì)胞類型.
三、ICICLE-seq聯(lián)合測量可及性和表位
A. 在標(biāo)準(zhǔn)的scATAC-seq協(xié)議下，細(xì)胞膜的去除切斷了細(xì)胞表面和細(xì)胞染色質(zhì)狀態(tài)之間的連接。為了測試我們在通透性細(xì)胞上同時測量細(xì)胞表面蛋白和染色質(zhì)狀態(tài)的能力，我們修改了我們優(yōu)化的通透性細(xì)胞scATAC-seq方法，將其納入使用商用條形碼抗體試劑的測量，我們將這種新方法稱為ICICLE-seq. ICICLE-seq協(xié)議利用定制的Tn5轉(zhuǎn)座復(fù)合體，其捕獲序列與基因組公司的10x scRNA-seq凝膠珠捕獲反應(yīng)兼容，可同時捕獲ATAC片段和多聚腺苷化抗體條形碼序列.
B. UMAP投影和ATAC標(biāo)記轉(zhuǎn)移在ICICLE-seq數(shù)據(jù)上的分辨率與scATAC-seq在死亡細(xì)胞和清除碎片后的完整通透細(xì)胞上的分辨率相似.
C. 然而，基于poly- based的捕獲方法和置換片段的單端讀出限制了數(shù)據(jù)質(zhì)量。盡管如此，ICICLE-seq結(jié)果表明，通透細(xì)胞能夠同時捕獲細(xì)胞核染色質(zhì)可達(dá)性和高質(zhì)量的細(xì)胞表面表位定量。我們能夠利用額外的ADT數(shù)據(jù)聚集并根據(jù)細(xì)胞表面抗原識別細(xì)胞類型.
D. E. 基于ADT數(shù)據(jù)的UMAP和Jaccard Louvain聚類可以根據(jù)細(xì)胞類型特異性標(biāo)記與聚類的明確關(guān)聯(lián)識別細(xì)胞類型特異性聚類。
四、TEA-seq轉(zhuǎn)錄本、表位和可及性的三峰測量
A. 隨著從單個核中同時捕獲RNA-seq和ATAC-seq的商業(yè)平臺的發(fā)布，我們推斷通透細(xì)胞可以用于同時捕獲三個主要的分子隔間:DNA可以用scATAC-seq捕獲，RNA可以用scRNA-seq捕獲，蛋白質(zhì)表位豐度可以用聚腺苷化抗體條形碼捕獲，我們根據(jù)轉(zhuǎn)錄本、表位表位和可及性將其稱為TEA-seq。經(jīng)過試驗和關(guān)鍵步驟的優(yōu)化后，我們能夠在10倍基因組Multiome ATAC +基因表達(dá)平臺上獲得文庫，該平臺使用46個低聚標(biāo)記抗體組合了數(shù)千個單細(xì)胞的所有三種測量結(jié)果.
B. D.在對裝入4孔的細(xì)胞進(jìn)行初始數(shù)據(jù)處理后，我們鑒定出29264個通過上述scATAC-seq QC標(biāo)準(zhǔn)的細(xì)胞條形碼，有2,500,500個獨(dú)特的ATAC-seq片段(中值= 8762個獨(dú)特的ATAC片段)，有>500個基因被scRNA-seq檢測到(中值= 2399個RNA UMIs;中位數(shù)=檢測到129,249個基因)，500個ADT UMIs.
G.H.更敏感的蛋白質(zhì)豐度測量允許檢測許多附加的相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，例如CCR2/CD192.
I.J. 一種單核細(xì)胞上表達(dá)的趨化因子受體和CD38，一種表達(dá)于多種免疫細(xì)胞表面的糖蛋白.