低氧導(dǎo)致肝細(xì)胞癌進(jìn)展的新連接體——CFL1蛋白
肝細(xì)胞癌(HCC)是全球第四大致命惡性腫瘤類型。然而，參與HCC進(jìn)展的確切分子機(jī)制尚不清楚。本研究發(fā)現(xiàn)缺氧誘導(dǎo)的CFL1通過激活PLD1/AKT通路增加HCC的增殖、遷移、侵襲和EMT。本文于2021年3月發(fā)表在《Clinical and Translational Medicine》IF：7.919期刊上。
技術(shù)路線：
主要實(shí)驗(yàn)結(jié)果：
門靜脈瘤血栓(PVTT)是HCC預(yù)后不良的重要危險(xiǎn)因素。取3對(duì)HCC和配對(duì)的PVTT組織進(jìn)行iRTAQ檢測(cè)，挖掘到946個(gè)差異表達(dá)蛋白。圖1A列舉了最顯著上調(diào)的10個(gè)蛋白，其中CFL1在HCC中顯著高表達(dá)。WB和免疫組化表明CFL1在癌旁組織，HCC和PVTT組織中表達(dá)逐漸上調(diào)（圖1B-C）。隨后在100對(duì)HCC和癌癥組織，以及6株細(xì)胞系中檢測(cè)了CFL1的表達(dá)，證實(shí)CFL1在HCC中高表達(dá)。
圖1 PVTT、HCC及癌旁非腫瘤組織中CFL1的表達(dá)
2、CFL1的高表達(dá)與HCC的不良預(yù)后相關(guān)
單變量分析顯示，腫瘤大小、腫瘤數(shù)量、TNM分期、靜脈浸潤(rùn)、HBV感染和CFL1水平與HCC患者的總體生存率顯著相關(guān)（表2）。多變量分析顯示，僅腫瘤大小、腫瘤數(shù)量、靜脈浸潤(rùn)和CFL1水平是HCC總體生存率的獨(dú)立預(yù)后指標(biāo)（表2）。并且，可以看出CFL1的高表達(dá)與HCC的不良預(yù)后相關(guān)。
3、CFL1促進(jìn)HCC的增殖，遷移和侵襲
如圖2所示，在高表達(dá)CFL1的HCCLM3和MHCC97h細(xì)胞中，敲除CFL1 (圖2A)。隨后實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)敲除CFL1后HCCLM3和MHCC97h細(xì)胞的增殖，遷移和侵襲能力被抑制，表明CFL1促進(jìn)HCC的增殖，遷移和侵襲。
4、CLF1敲除抑制小鼠HCC的生長(zhǎng)和肺部轉(zhuǎn)移
隨后，作者在體內(nèi)進(jìn)一步驗(yàn)證CLF1的功能。結(jié)果如圖3所以，敲除CFL1后顯著降低了HCC細(xì)胞的腫瘤體積和腫瘤，并減少了肺轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)數(shù)量。IHC表明CLF1的敲除也導(dǎo)致EMT相關(guān)蛋白的抑制?？傊?/span>CLF1敲除抑制小鼠HCC的生長(zhǎng)和肺部轉(zhuǎn)移。
圖3 CLF1敲除抑制小鼠HCC的生長(zhǎng)和肺部轉(zhuǎn)移
5、CFL1是HIF-1α在HCC細(xì)胞中的下游靶基因
為了闡明低氧對(duì)HCC中CFL1表達(dá)的影響，將HCCLM3和Hep3B細(xì)胞在低氧培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h。結(jié)果發(fā)現(xiàn)低氧誘導(dǎo)導(dǎo)致CFL1的表達(dá)升高，但是當(dāng)HIF-1α敲除后，低氧誘導(dǎo)并不能提高CFL1的表達(dá)，并且使用HIF-1α的抑制劑處理HCCLM3和Hep3B細(xì)胞，也能降低因低氧誘導(dǎo)導(dǎo)致CFL1表達(dá)升高（圖4A-F）。ChIP-PCR檢測(cè)進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，HIF-1α和HIF-1β與HCC細(xì)胞CFL1啟動(dòng)子中的HRE直接結(jié)合（圖4G）。在低氧條件下，轉(zhuǎn)染HRE熒光素酶質(zhì)?；?/span>CFL1啟動(dòng)子-熒光素酶質(zhì)粒的HEK 293T細(xì)胞中熒光素酶報(bào)告基因活性升高（圖4H）。
圖4 HIF-1α激活HCC細(xì)胞中CFL1的轉(zhuǎn)錄
接下來，在低氧條件下，在HCCLM3和Hep3B細(xì)胞中敲低CFL1的表達(dá)（圖5A）。結(jié)果表明，CFL1敲除顯著逆轉(zhuǎn)了缺氧誘導(dǎo)的HCCLM3細(xì)胞增殖、細(xì)胞遷移和侵襲以及EMT（圖5A-D）。綜上所述，這些結(jié)果表明CFL1表達(dá)受HIF-1α的轉(zhuǎn)錄調(diào)控，介導(dǎo)缺氧誘導(dǎo)的HCC進(jìn)展。
圖5 CFL1敲除逆轉(zhuǎn)了HIF誘導(dǎo)的HCC細(xì)胞的增殖和侵襲
6、CFL1通過抑制泛素介導(dǎo)的PLD1降解來維持PLD1的表達(dá)
為了進(jìn)一步探索CFL1在HCC中致癌作用的下游機(jī)制，利用KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)篩選了受CFL1影響的通路。其中CFL1的高表達(dá)與細(xì)胞膜中細(xì)胞粘附分子和蛋白的定位密切相關(guān)（圖6A）。然后，基于蛋白質(zhì)相互作用數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)了CFL1和PLD1之間的潛在相互作用（圖6B）。CFL1敲低降低了HCCLM3細(xì)胞中PLD1的蛋白水平，而CFL1過表達(dá)增強(qiáng)了Hep3B細(xì)胞中PLD1蛋白表達(dá)（圖6C）。co - IP實(shí)驗(yàn)表明，CFL1與PLD1相互作用，敲低CFL1可促進(jìn)肝癌細(xì)胞中PLD1的泛素化(圖6D-E)。用放線菌酮(CHX，2μg/mL)阻斷肝癌細(xì)胞蛋白質(zhì)合成。繪制蛋白降解曲線，表明CFL1敲低時(shí)PLD1蛋白降解更快（圖6F）。此外，蛋白酶體抑制劑MG132(25 μM)處理可阻斷CFL1敲低誘導(dǎo)的HCC細(xì)胞中PLD1降解（圖6F）。因此，這些結(jié)果表明CFL1抑制肝癌細(xì)胞中泛素介導(dǎo)的PLD1蛋白水解。
圖6 CFL1調(diào)節(jié)HCC細(xì)胞中PLD1的降解
7、CFL1/PLD1軸介導(dǎo)低氧誘導(dǎo)的HCC細(xì)胞中AKT途徑的激活
之前的一項(xiàng)研究表明，PLD1激活AKT及其下游mTOR通路促進(jìn)HCC細(xì)胞增殖、侵襲。與此一致，作者觀察到CFL1敲除降低了p-AKT水平，在HCCLM3細(xì)胞中通過PLD1恢復(fù)增強(qiáng)了p-AKT水平（圖7A，C）。此外，PLD1沉默逆轉(zhuǎn)了CFL1誘導(dǎo)的Hep3B細(xì)胞中AKT信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的活化（圖7B，D）。值得注意的是，CFL1或PLD1敲除抑制了肝癌細(xì)胞中缺氧誘導(dǎo)的AKT通路激活和EMT過程（圖7E，F）。之后，進(jìn)行拯救實(shí)驗(yàn)探討HIF-1α-CFL1-PLD1軸中PLD1的功能。在HCCLM3細(xì)胞中過表達(dá)的PLD1可以逆轉(zhuǎn)低氧條件下CFL1-shRNA引起的對(duì)AKT磷酸化或EMT過程的抑制（圖7G，H）?？偟膩碚f，證實(shí)CFL1/PLD1軸在缺氧誘導(dǎo)的HCC進(jìn)展中起重要作用。
圖7 CFL1/PLD1軸介導(dǎo)低氧誘導(dǎo)的HCC細(xì)胞中AKT途徑的激活
總之，該研究表明HCC中過表達(dá)CFL1與較差的臨床病理學(xué)參數(shù)呈正相關(guān)。體外和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)證實(shí)CFL1是HCC腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移的驅(qū)動(dòng)因素。PDL1/AKT通路介導(dǎo)CFL1的致癌功能。此外，CFL1是一個(gè)缺氧反應(yīng)基因，通過激活PLD1/AKT信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)參與缺氧誘導(dǎo)的HCC進(jìn)展（圖8）。綜上所述，該研究表明CFL1是低氧微環(huán)境與HCC進(jìn)展之間的一種新的連接體。
圖8本研究結(jié)果的示意圖
參考文獻(xiàn)：
Yao Bowen., Li Yazhao., Chen Tianxiang., Niu Yongshen., Wang Yufeng., Yang Yuanyuan., Wei Xinyu., Liu Qingguang., Tu Kangsheng.(2021). Hypoxia-induced cofilin 1 promotes hepatocellular carcinoma progression by regulating the PLD1/AKT pathway. Clin Transl Med, 11(3), e366. doi:10.1002/ctm2.366