治療有望：間充質(zhì)干細(xì)胞移植促進(jìn)CD4+T細(xì)胞衰老改善紅斑狼瘡

人類(lèi)人臍帶來(lái)源的間充質(zhì)干細(xì)胞（hUC-MSCs）移植被證實(shí)是治療系統(tǒng)性紅斑狼瘡（SLE）的有效方法，但是詳細(xì)的潛在機(jī)制仍不明確。轉(zhuǎn)運(yùn)miRNAs可能是MSCs交流其它細(xì)胞的方法。Sirt1是一種NAD依賴(lài)的去乙?；?，通過(guò)去乙酰化p53來(lái)防止細(xì)胞衰老。本研究旨在探討在MRL/lpr狼瘡小鼠模型中，hUC-MSCs是否通過(guò)miRNA調(diào)節(jié)Sirt1/p53來(lái)影響脾CD4+ T細(xì)胞的衰老。本文于2021年1月發(fā)表在《Theranostics》IF：8.597期刊上。

技術(shù)路線

主要實(shí)驗(yàn)結(jié)果

1、hUC-MSCs減輕緩解MRL/lpr小鼠的疾病進(jìn)展

為了評(píng)估對(duì)MRL/lpr小鼠狼瘡綜合征的治療作用，從17周齡開(kāi)始用5 × 10⁵ hUC-MSCs或PBS治療MRL/lpr小鼠，并在21周齡時(shí)處死所有小鼠(圖1A)。與PBS處理的小鼠相比，hUC - MSC處理的小鼠的腎臟病變明顯減少(圖1B)。此外，與PBS處理的MRL/lpr小鼠相比，hUC-MSCs處理后小鼠的脾臟重量和蛋白尿明顯降低 (圖1C - D)。hUC - MSCs治療組的血清anti-dsDNA抗體水平較低，但未達(dá)到統(tǒng)計(jì)學(xué)水平 (圖1E)。數(shù)據(jù)表明hUC-MSCs改善MRL/lpr小鼠的狼瘡疾病。

圖1 hUC-MSCs減輕緩解MRL/lpr小鼠的疾病進(jìn)展

2、hUC-MSCs增加MRL/lpr小鼠脾CD4+ T細(xì)胞的衰老通過(guò)Sirt1/p53信號(hào)

作者推測(cè)hUC-MSCs治療MRL/lpr小鼠的潛在機(jī)制可能是通過(guò)增強(qiáng)CD4+ T細(xì)胞的衰老來(lái)抑制其積累。為了驗(yàn)證這一點(diǎn)，作者從脾細(xì)胞懸液中分離出單核細(xì)胞，然后純化CD4+ T細(xì)胞用于RNA和蛋白質(zhì)制備。測(cè)量了p21和p16水平作為早衰的標(biāo)記物。結(jié)果顯示與WT對(duì)照組相比，p21和p16的mRNA和蛋白質(zhì)水平在MRL/lpr小鼠中顯著降低，與此同時(shí)，與接受PBS處理的MRL/lpr小鼠相比， p21和p16的mRNA和蛋白表達(dá)在hUC-MSCs治療組中顯著增加 (圖2A-C)。研究還發(fā)現(xiàn)，與WT小鼠相比，MRL/lpr脾臟CD4+ T細(xì)胞的Sirt1表達(dá)水平升高，在Lys-379位點(diǎn)的p53乙?；浇档?，而hUC-MSCs治療可以通過(guò)降低Sirt1水平、增加p53水平和p53乙酰化水平來(lái)逆轉(zhuǎn)這一變化(圖2C - E)?？傊鲜鼋Y(jié)果提示，MRL/lpr小鼠脾臟CD4+ T細(xì)胞的衰老可能是有缺陷的由于Sirt1/p53的信號(hào)改變導(dǎo)致，這可能導(dǎo)致CD4+ T細(xì)胞的過(guò)度增殖。因此，hUC-MSCs的臨床作用可能與脾CD4+ T細(xì)胞衰老通路的恢復(fù)有關(guān)。

圖2 hUC-MSCs治療使MRL/lpr小鼠脾CD4+ T細(xì)胞的衰老標(biāo)記物在體內(nèi)恢復(fù)正常

3、hUC-MSCs在體外增加MRL/lpr小鼠脾CD4+ T細(xì)胞的衰老通過(guò)Sirt1

在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)的同時(shí)，在體外測(cè)定了hUC-MSCs對(duì)T細(xì)胞衰老的影響。MRL/lpr小鼠脾CD4+ T細(xì)胞與hUC-MSCs以不同比例(CD4+ T細(xì)胞:MSCs: 1:1、10:1、50:1)共培養(yǎng)48 h。結(jié)果發(fā)現(xiàn)hUC-MSCs呈劑量依賴(lài)性方式顯著上調(diào)p21和p16的水平，但下調(diào)Sirt1的水平 (圖3A-C)。此外，細(xì)胞衰老的調(diào)節(jié)并不依賴(lài)于細(xì)胞與細(xì)胞之間的接觸，用transwell系統(tǒng)分離培養(yǎng)的CD4+ T細(xì)胞和MSCs時(shí)也發(fā)現(xiàn)了類(lèi)似的結(jié)果(圖3D - F)。這些數(shù)據(jù)表明，可溶性因子介導(dǎo)了hUC-MSCs對(duì)MRL/lpr小鼠脾CD4+ T細(xì)胞衰老的調(diào)節(jié)作用。

圖3 hUC-MSCs體外增加脾CD4+ T細(xì)胞衰老標(biāo)志物

4、Sirt1是在MRL/lpr小鼠中hUC - MSCs介導(dǎo)的CD4+ T細(xì)胞衰老所必須的

接下來(lái)，檢測(cè)了Sirt1是否是hUC-MSCs促進(jìn)MRL/lpr脾CD4+ T細(xì)胞衰老所足夠和必要的。研究發(fā)現(xiàn)，使用Sirt1抑制劑- EX527預(yù)處理MRL/lpr小鼠的CD4+ T細(xì)胞后，Sirt1的表達(dá)減弱，p21和p16的表達(dá)和p53的乙?；骄黾恿?/span> (圖4A)。相反地，用Sirt1的選擇性激活劑SRT1720預(yù)處理MRL/lpr小鼠的CD4+ T細(xì)胞后，可以抑制hUC-MSCs誘導(dǎo)的衰老(圖4B)。綜上所述，這些數(shù)據(jù)表明Sirt1是hUC-MSCs增加MRL/lpr小鼠脾CD4+ T細(xì)胞衰老的關(guān)鍵介質(zhì)。

圖4 Sirt1是hUC-MSCs增加MRL/lpr小鼠脾CD4+ T細(xì)胞衰老的中介物

5、hUC-MSCs調(diào)節(jié)MRL/lpr小鼠脾CD4+T細(xì)胞Sirt1/p53信號(hào)通過(guò)miR-199a-5p

文獻(xiàn)報(bào)道在癌癥和自身免疫疾病中，hUC-MSCs能夠?qū)?/span>miRNAs轉(zhuǎn)移到周?chē)募?xì)胞。因此，作者考慮miRNAs是否可能參與hUC - MSCs介導(dǎo)的對(duì)脾CD4+ T細(xì)胞中Sirt1的表達(dá)調(diào)控。使用在線軟件Target scan識(shí)別了10個(gè)miRNA，這些miRNA被預(yù)測(cè)靶向Sirt1。qPCR分析顯示，在這10個(gè)miRNAs中，只有miR-199a-5p的表達(dá)在MRL/lpr脾CD4+ T細(xì)胞中顯著降低(圖5A)。此外，miR-199a-5p是hUC-MSCs處理后唯一表達(dá)增加的miRNA(圖5A)。事實(shí)上，miR-199a-5p mimic不僅可以提高MRL/lpr脾CD4+ T細(xì)胞中miR-199a-5p的水平，降低Sirt1的表達(dá)(圖5B-C)，而且還可以提高衰老標(biāo)志物p21、p16和乙?；?/span>p53的表達(dá)水平(圖5D)。相反，miR-199a-5p抑制劑處理可提高WT小鼠脾CD4+ T細(xì)胞中Sirt1的表達(dá)(圖5E)，并降低衰老標(biāo)志物p21, p16和乙酰p53水平(圖5F)。最后，與MRL/lpr相比，hUC-MSCs可增加miR-199a-5p的產(chǎn)生，表明hUC-MSCs是miR-199a-5p來(lái)源的關(guān)鍵調(diào)控因子 (圖5G)。在transwell系統(tǒng)中，hUC-MSCs與MRL/lpr脾CD4+ T細(xì)胞共培養(yǎng)48 h后，細(xì)胞內(nèi)miR-199a-5p升高，Sirt1基因表達(dá)降低，CD4+ T細(xì)胞中衰老標(biāo)志物的表達(dá)水平恢復(fù)，而miR-199a-5p抑制劑處理后仍處于抑制狀態(tài)(圖5G-I)。總的來(lái)說(shuō)，這些數(shù)據(jù)表明hUC-MSCs通過(guò)miR-199a-5p介導(dǎo)的Sirt1下調(diào)和隨后p53去乙?；臏p少，增加了脾臟CD4+ T細(xì)胞的衰老。

圖5 hUC-MSCs誘導(dǎo)的miR-199a-5p可增加MRL/lpr脾CD4+ T細(xì)胞衰老

6、MiR-199a-5p改善MRL/lpr小鼠疾病

接下來(lái)，在體內(nèi)評(píng)估了miR-199a-5p對(duì)MRL/lpr小鼠的影響。17周齡MRL/lpr小鼠每4天注射20 nmol miR-199a-5p agomir或?qū)φ?/span>(agomir nc)，共4周(圖6A)。末次注射后48 h處死小鼠，分離脾臟CD4+ T細(xì)胞。與對(duì)照組相比，miR-199a-5p agomir處理組顯示miR-199a-5p水平升高(圖6B)， Sirt1表達(dá)降低(圖6C)，衰老標(biāo)志物p21和p16的表達(dá)顯著上調(diào)(圖6D)。這些數(shù)據(jù)表明hUC-MSCs通過(guò)miR-199a-5p增加MRL/lpr脾CD4+ T細(xì)胞衰老。

圖6 MiR-199a-5p agomir處理增加MRL/lpr脾CD4+ T細(xì)胞的衰老

接下來(lái)，研究系統(tǒng)給予miR-199a-5p agomir是否能挽救MRL/lpr小鼠的狼瘡表型。與agomir nc組相比，miR-199a-5p agomir處理組脾臟和淋巴結(jié)明顯縮小(圖7A-B)，血清中anti-dsDNA抗體、IgG水平下降(圖7D-E)。血清ANA水平有下降趨勢(shì)(圖7C)。miR-199a-5p agomir處理組的腎損傷，表現(xiàn)為尿蛋白下降（圖7F），腎小球增大和細(xì)胞增生減少(圖7G)，外周毛細(xì)血管袢中IgG沉積減少(圖7h)。綜上所述，這些數(shù)據(jù)表明hUC-MSCs移植通過(guò)miR -199a-5p介導(dǎo)的Sirt1信號(hào)下調(diào)從而增加脾CD4+ T細(xì)胞的衰老，改善MRL/lpr小鼠的疾病表型。

圖7 MiR-199a-5p agomir治療可改善MRL/lpr小鼠的疾病表型和免疫紊亂

參考文獻(xiàn)：

Cheng Tao., Ding Shuai., Liu Shanshan., Li Yan., Sun Lingyun.(2021). Human umbilical cord-derived mesenchymal stem cell therapy ameliorates lupus through increasing CD4+ T cell senescence via MiR-199a-5p/Sirt1/p53 axis. Theranostics, 11(2), 893-905. doi:10.7150/thno.48080