CD8+T細胞是最重要的癌癥適應(yīng)性免疫調(diào)節(jié)細胞,通過直接殺死癌細胞來介導抗腫瘤免疫。PD-1抑制激活CD8 + T細胞以增加T細胞免疫力,從而導致癌癥消退。因此,CD8 + T細胞的激活可能是通過免疫療法治療LSCC的關(guān)鍵。
這篇文章以生信分析開篇,篩選出關(guān)鍵基因后在動物模型與臨床樣本中進行了簡單的驗證。實驗思路如下:
1. 下載GEO數(shù)據(jù)并進行數(shù)據(jù)篩選
下載數(shù)據(jù)集GSE17710,選擇變異系數(shù)>0.1的5000個基因進行后續(xù)WGCNA分析
2. CIBERSORT分析免疫浸潤
分析獲得每個樣本中22種免疫細胞的豐度,選擇T細胞作為WGCNA分析的性狀集合(其中,T細胞包括7中亞型)
3. WGCNA構(gòu)建基因網(wǎng)絡(luò)
使用R包“ WGCNA”對5000個WGCNA分析,構(gòu)建LSCC基因共表達網(wǎng)絡(luò),軟閾值β= 5(R2 = 0.9)構(gòu)建無標度網(wǎng)絡(luò)。動態(tài)混合切割來建立分層聚類樹,樹枝代表了一系列具有相似表達數(shù)據(jù)的基因,每個樹葉代表了樹上的單個基因。生成了十八個模塊。
4. 篩選關(guān)鍵模塊(hub module)并進行富集分析
分析發(fā)現(xiàn),棕色模塊與CD8+T細胞顯著相關(guān)(R 2 = -0.05,P = 9e-05),因此選擇棕色模塊為hub module進行富集分析。
5. 在hub module中篩選出關(guān)鍵基因(hub gene)并驗證
為了研究與樞紐模塊中CD8 + T細胞浸潤相關(guān)的潛在樞紐基因,構(gòu)建了蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用(PPI)網(wǎng)絡(luò)[臨界標準:reliability > 0.7 and connectivity > 15 (node/edge)]將hub module中的基因識別為中心節(jié)點,并通過Cytoscape對其進行可視化;對hub module中所有基因進行基于TCGA數(shù)據(jù)的預(yù)后分析,八個基因(CLCN2,ERLIN2,F(xiàn)5,F(xiàn)AM107B,GFM1,HSPB3,METTL8和SYT3)與LSCC患者的預(yù)后相關(guān),接下來對這8個基因進行差異表達分析,六個基因(GFM1,HSPB3,SYT3,ERLIN2,METTL8和CLCN2)在LSCC組織中顯著差異表達。
6. 分析hub gene與臨床免疫指標的相關(guān)性
根據(jù)cBioPortal數(shù)據(jù)庫、TIMER數(shù)據(jù)庫對上述6基因進行進一步分析,并且計算了與CD8 + T細胞浸潤水平的相關(guān)性,發(fā)現(xiàn)METTL8,HSPB3和ERLIN2)浸潤水平之間的顯著相關(guān)。
7. 鑒定預(yù)后標志物
通過基于GENT2數(shù)據(jù)庫的Meta生存分析,分析了METTL8,HSPB3和ERLIN2。 結(jié)果表明,METTTL8和HSPB3的有較大的預(yù)后價值。 使用Kaplan–Meier檢測了METTL8,HSPB3和ERLIN2的預(yù)后價值,結(jié)果表明METTL8和ERLIN2與負面預(yù)后顯著相關(guān)。接下來,選擇METTL8作為預(yù)后的生物標志物,以進行進一步的分析。
8. 預(yù)后標志物METTL8基因富集分析
根據(jù)METTL8表達水平的中位數(shù),將基于TCGA數(shù)據(jù)庫的LSCC表達圖譜分為高水平組和低水平組以進行GSEA分析。
9. 預(yù)后標志物METTL8的功能驗證
在細胞中進行METTL8的敲低,結(jié)果表明METTL8的敲低可能抑制細胞凋亡、增殖能力,影響細胞周期。
在小鼠異種移植成瘤實驗中,進行METTL8的干擾,結(jié)果表明METTL8的敲低抑制腫瘤生長,一直細胞增殖和周期。
在正常肺組織與LSCC組織中檢測相關(guān)指標表達情況,與正常組織相比,LUSC組織中METTL8顯著高表達,CD8顯著低表達。
綜上, METTL8在LSCC腫瘤的免疫浸潤中起關(guān)鍵作用。