CDK4/6抑制通過誘導T細胞記憶促進抗腫瘤免疫

細胞周期蛋白依賴性激酶4和6(CDK4/6)的藥理學抑制劑是激素受體陽性乳腺癌的獲批治療藥物，目前正在其他癌癥類型的數百項臨床試驗中進行評價。這些抑制劑的臨床成功在很大程度上歸因于定義明確的腫瘤內在細胞抑制機制，而其作為免疫調節(jié)劑的新作用知之甚少。本研究利用整合的表觀基因組、轉錄組學和蛋白質組學分析，證明了CDK4/6抑制劑在促進免疫T細胞記憶的表型和功能獲得中的新作用。本文的機制見解拓寬了CDK4/6抑制劑作為增強抗腫瘤T細胞免疫的臨床工具的前瞻性效用。本研究于2021年5月14日發(fā)表在《Cancer Discovery》IF:29.497期刊上。

技術路線：

主要實驗結果：

1、在響應CDK4/6抑制中瘤內記憶類CD8+ T細胞的表現

為了全面評價CDK4/6抑制對抗腫瘤T細胞免疫的影響，使用多模式單細胞測序(CITE-seq)分析了CDK4/6抑制劑palbociclib或對照處理的MC38-OVA腫瘤小鼠的瘤內T細胞群體 (Fig. 1A)。維度分析顯示MC38-OVA腫瘤中有10個不同的T細胞群(Fig. 1B)。用CDK4/6i處理的腫瘤有較低頻率的CD4+調節(jié)性T細胞(Foxp3+ Tregs)，而CD8+記憶類T細胞頻率更高，以Tcf7、Sell、Bcl2和Cd7高表達為特征(Fig. 1B-D)。CD8+ T細胞池的基因動態(tài)表達揭示來源于CDK4/6i處理的小鼠的CD8+腫瘤免疫浸潤（TILs）向更早、更像干細胞的分化狀態(tài)傾斜(Fig. 1E-F)。與此一致，較早出現假時間軌跡的細胞表達更高水平的記憶相關基因(Tcf7, Sell, Il7r)，和更低水平的效應相關基因(Prf1, Gzmb)和耗損標志物(PD-1, TIM3) (Fig. 1G)。支持了轉錄組學分析，流式細胞術表明帶有中央記憶(Tcm)表型(CD44+CD62L+)的CD8+ TILs的比例顯著更高，這在不同的腫瘤模型中是一致的(Fig. 1H)。為了檢驗抑制CDK4/6對抗腫瘤T細胞免疫的長期功能效應，用CDK4/6i在短時間 (抗腫瘤T細胞反應最活躍的3-13天)處理MC38-OVA荷瘤小鼠，然后停藥。在停止治療時，CDK4/6i處理小鼠和對照小鼠的腫瘤體積是相等的(Fig. 1I-J)。引人注目的是，在停止治療后，既往使用CDK4/6i治療的小鼠中有21只小鼠腫瘤完全清除，而對照組只有9只(Fig. 1K)。總之，這些數據表明CDK4/6的藥理抑制促進T細胞記憶，并產生能夠驅動有效和持續(xù)的抗腫瘤反應的瘤內T細胞室。

圖1用CDK4/6抑制劑處理的小鼠出現瘤內記憶類CD8+ T的細胞。

2、CDK4/6i介導的CD8+ T細胞記憶獲得是細胞固有的

為了確定在CDK4/6i處理的腫瘤中觀察到的T細胞記憶是否由于CDK4/6在這些細胞內的直接抑制，在體外將活化的小鼠CD8+ T細胞暴露于CDK4/6i中，并監(jiān)測Tcm獲取和分裂數。激活CDK4/6i暴露0、24、72 h后，Tcm細胞平均分裂數減少，同時細胞比例增加，且呈劑量依賴性，僅在24 h內發(fā)生(Fig. 2A)。這表明CDK4/6i不是簡單地抑制分化，而是直接促進記憶形成，表明細胞周期機制與分化之間存在方向性關系。通過3'RNA-seq進一步分析發(fā)現，在CDK4/6i處理后，記憶相關轉錄本增加，GSEA分析證實了記憶相關特征的富集，以及細胞周期相關特征的減少，包括E2F靶點(Fig. 2B-E)。矛盾的是，CDK4/6抑制也誘導了效應相關轉錄本，包括Gzma、Gzmc和Pdcd1 (Fig. 2B-C)，這與之前CDK4/6i促進T細胞活化的報道一致。

基序分析發(fā)現E2F TF基序在乙?；档拖嚓P區(qū)域顯著富集，在T細胞記憶驅動因子相關基序乙?；黾?，包括含叉頭框因子(Fig. 2F)。為了確定這些變化是否伴隨著對不同細胞狀態(tài)的長期表觀遺傳影響，在CDK4/6抑制后對體外活化的T細胞進行了ATAC-seq，觀察到染色質開放性的整體降低，T細胞記憶相關基因區(qū)域的開放性增加，包括Tcf7、Ccr7和Sell (Fig. 2G)。為了解開CDK4/6抑制后記憶和效應特征的明顯二分法，在暴露于CDK4/6i 24h后，對體外活化T細胞進行了單細胞RNA-seq。該分析顯示存在CDK4/6i處理后改變的不同T細胞亞群，簇2、4、5和8增加，簇0減少，以及整體G1細胞周期停滯(Fig. 2H-I)。接下來對記憶和效應基因標記，并使用AUCell比較富集評分，確定細胞池中不同的記憶樣和效應樣簇(Fig. 2J)。有趣的是，CDK4/6i處理后增加的細胞簇2和5是記憶樣細胞，8是效應樣細胞，證明CDK4/6i抑制促進異質T細胞池中表型不同的亞群細胞的記憶分化，增強效應功能。

圖2 CDK4/6i介導的CD8+ T細胞記憶獲得是細胞固有的

3、CDK4/6抑制劑促進記憶形成通過RB介導的G1停滯

為了確定驅動CDK4/6i誘導的記憶，對調節(jié)記憶標記的基因CD62L (SELL)，進行了全基因組CRISPR/Cas9篩選，用基因組范圍的sgRNA文庫轉導表達Cas9的Jurkat T細胞（CDK4/6抑制后上調CD62L），然后用CDK4/6i處理，并對未能上調CD62L的細胞進行熒光激活細胞分選(Fig. 3A)。對分選群體進行測序發(fā)現，靶向RB轉錄共抑制因子1(RB1)的sgRNA僅在處理條件下顯著富集(Fig. 3B)，暗示RB是CDK4/6i誘導CD62L上調所必須的。隨后對急性(2h)暴露于CDK4/6i后的Jurkat細胞和活化的原代小鼠CD8 + T細胞進行了整體磷酸化蛋白質組學分析(Fig. 3C)。在Jurkat和小鼠T細胞中檢測到多個肽上特異性磷酸化位點的顯著缺失，包括典型的CDK4/6靶標RB和RBL 1/2 (Fig. 3D-F)。值得注意的是，RB在兩種細胞蛋白組學中重疊，并且是全基因組CRISPR/Cas9篩選最顯著的（Fig. 3B，3G），表明CDK4/6i介導的記憶形成是由RB介導。因此，靶向敲除RB1，可以消除CD62L的表達上調(Fig. 3H)。3’RNA-seq分析顯示RB缺失廢除了轉錄對CDK4/6i的響應，包括SELL，其被CDK4/6i誘導的轉錄改變被RB缺失所大幅度減弱了(Fig. 3I)。與此一致，靶向敲除RB1也廢除了激活的初級小鼠CD8+T細胞的Tcm形成(Fig. 3J)。

為了確定CDK4 /6i誘導的記憶形成是否通過細胞周期的RB介導的G1期阻滯，用G1阻滯劑處理細胞，胸腺嘧啶，通過阻止DNA合成和進入S期，獨立于RB的誘導G1阻滯。結果顯示胸腺嘧啶處理的細胞表型復制了CDK4/6抑制，并在很大程度上挽救了Rb1 KO細胞中Tcm的形成(Fig. 3J) ，表明RB介導的G1阻滯本身有助于CDK4 /6i誘導的記憶分化。通過3'RNA-seq進一步分析Rb1 KO細胞，發(fā)現記憶相關基因下調和效應標記增加（圖3K-L），CDK4/6抑制后未能逆轉（圖3M-N）。這些結果表明CDK4/6i介導的轉錄重編程和記憶形成是通過RB依賴的G1細胞周期停滯和同時抑制CDK4/6信號轉導。

圖3 CDK4/6抑制劑促進記憶形成通過RB

4、CDK4/6預處理增強功能性記憶CD8+ T細胞的持久性

長期生存能力是T細胞記憶的基本特征。為了確定CDK4/6i處理的細胞在體內是否表現出優(yōu)越的存活率，將未處理和CDK4/6i預處理的體外活化CD45.1 OT-i T細胞轉移至同源CD45.2小鼠中，并通過流式細胞術評價其隨時間的持續(xù)性和表型（Fig. 4A）。在30天內，在血液和脾臟中檢測到的預處理OT-I - T細胞的頻率明顯更高（Fig. 4B）。30天后，未處理和預處理的OT-I - T細胞在血液和脾臟中的表型持久性相似，都具有記憶前體的特征 (MPECs; KLRG1-CD127+) (Fig. 4C)。為了評價CDK4/6i處理細胞的記憶能力，將未處理或體外活化的CD45.1 OT-i T細胞中預處理的細胞再次轉移至同源CD45.2宿主中。30d后，分離出OT-ⅠT細胞，等量重新轉移到同時感染李斯特菌-OVA(LM-OVA)的新宿主中（Fig. 4D)。未處理和預處理的OT-I T細胞在LM-OVA感染后擴增和分化，迅速獲得功能性、產生細胞因子的SLEC表型(KLRG1 + CD127-)（Fig. 4E-F）。這些表明CDK4/6抑制驅動T細胞記憶的表型和功能獲得。

然后使用單細胞RNA-seq來描述移植后30天脾臟中存留的T細胞的轉錄譜（Fig. 4G）。使用pseudobulk RNA-seq分析和預轉移體外培養(yǎng)的基因比較，生成了持續(xù)細胞的基因標記，其標志是記憶相關基因(Sell，Foxp1，Tcf7，Cd7，Il7r，Klf2，Ccl5)的高表達和效應相關基因(Gzmd，Ifng，Prf1，Gzma，Gzmb)的低表達(Fig. 4H-I)。對先前的體外單細胞數據（Fig. 2H-J）的進一步分析顯示，CDK4/6i處理后，具有這種持續(xù)性特征的細胞頻率從7.5%增加至26.8%（Fig. 4J-K）。這些數據表明，抑制CDK4/6促進T細胞向真實的記憶表型分化，其特征是功能的長期持久性。

圖4CDK4/6預處理增強功能性記憶CD8+ T細胞的持久性

5、CDK4/6預處理增強CAR-T細胞的持久性和有效性

接下來測試CDK4/6i處理是否會誘導嵌合抗原受體(CAR)-T細胞的記憶表型，并克服CAR-T細胞治療成功的兩大障礙：T細胞耗竭和缺乏持久性。通過臨床試驗，以Lewis Y (LeY)抗原為靶點，制造了人類CAR-T細胞 (Fig. 5A)并發(fā)現暴露于CDK4/6i產生CD4+和CD8+干細胞記憶（Tscm）CAR-T細胞 (Fig. 5B)。CAR-T細胞的3’RNA-seq揭示CDK4/6抑制后記憶表達顯著改變，GSEA分析證實了記憶相對效應信號的富集，并如預期E2F靶基因下調 (Fig. 5C)。為了檢測在體內的持久性，使用兩個獨立供體的PBMC生成的LeY CAR-T細胞用CDK4/6i預處理，并轉移到NSG小鼠中(Fig. 5D)。與未經處理的對照組相比，觀察到在移植后的幾周內，血液中CD8+和CD4+預處理的CAR-T細胞的頻率和數量顯著增加(Fig. 5E-F)。為了評估這些CAR-T細胞的功能性記憶能力，在CAR-T細胞轉移后30天用LeY + 卵巢癌細胞系OVCAR-3(Fig. 5D)處理小鼠，觀察到與未處理的CAR組相比，預處理的CAR-T細胞在小鼠血液中的擴增顯著增加(Fig. 5G)。意味著先前接受過CAR-T細胞治療的小鼠的腫瘤控制顯著增強(Fig. 5H-I)。值得注意的是，第30天的腫瘤大小與腫瘤侵襲前血液中CD3+ T細胞的數量呈顯著負相關(Fig. 5J)，表明CDK4/6i處理的CAR-T細胞的持久性增強是驅動腫瘤控制的關鍵因素。事實上，腫瘤接種后40天，接受預處理的CAR-T細胞的小鼠浸潤CD4+和CD8+ CAR-T細胞的數量顯著增加(Fig. 5K)。接下來通過將未處理或預處理的抗LeY CAR-T細胞轉移到OVCAR-3荷瘤小鼠體內，檢測了CDK4/6i預處理對CAR-T細胞急性療效的影響。用CDK4/6i預處理CAR-T細胞可顯著增強其抗腫瘤活性（Fig.5L-M)。與此一致，轉移后數周發(fā)現接受預處理細胞的小鼠血液中CD4 + 和CD8 + 細胞以及腫瘤中CD8 + 細胞數量顯著增高（Fig.5N-O)?？傊?，這些數據證明CDK4/6i體外治療是增強CAR-T細胞表型和長期療效的穩(wěn)健策略。

圖5 CDK4/6預處理增強CAR-T細胞的持久性和有效性

6、CDK4/6抑制誘導T細胞表型與免疫檢查點封鎖的良好反應相關

在臨床小鼠模型中，CDK4/6抑制劑與ICB顯示出顯著的協同作用。鑒于最近的研究強調腫瘤微環(huán)境中的干細胞樣T細胞是ICB反應的關鍵介質，作者假設CDK4/6i介導的T細胞記憶誘導產生了更有利的T細胞池用于免疫檢查點靶向治療，因此將有助于該聯合治療的療效。事實上，這種CDK4/6i應答特征富集在ICB應答患者的CD8 + TIL中，在單細胞和患者水平準確分為應答者和非應答者（Fig.6A-D）。這表明CDK4/6i誘導了T細胞內基因特征，該特征與患者對ICB的良好反應相關。

作者收集并分析了黑色素瘤患者在治療過程中的連續(xù)血液樣本，在此期間，患者接受CDK4/6i聯合靶向MEK抑制劑治療，隨后接受PD-1和CTLA-4 ICB聯合治療（Fig.6 F），患者達到完全緩解。使用CITE-seq技術評估一系列患者樣本，觀察到CDK4/6i + MEKi治療后CD8 + T細胞記憶群的頻率呈時間依賴性增加，其特征為SELL、IL7R和TCF7的高表達（Fig.6G-I），這與臨床分析一致。事實上，偽時間分析揭示了從記憶樣群體到效應細胞的分化軌跡，CDK4/6i在該軌跡早期抑制CD8 + T細胞，隨后的ICB治療加速了分化（Fig.6J）?？缭皆摃r間的TCR克隆追蹤也發(fā)現，CDK4/6抑制增加了罕見T細胞克隆的頻率，主要存在于記憶群體內，隨后ICB處理擴增了這些克?。?/span>Fig.6K）。這表明ICB治療釋放了外周血中更多種類T細胞受體?？傊@些數據表明，CDK4/6i可用作ICB給藥前促進更有利T細胞表型的啟動工具。

圖6 CDK4/6抑制誘導ICB響應T細胞表型

這項研究證明了在細胞毒性T細胞中藥理學抑制CDK4/6可誘導RB介導的G1期阻滯，并促進記憶表型的獲得，可顯著增強這些細胞的長期抗腫瘤活性(Fig. 7)。

圖7 CD8+ T細胞CDK4/6抑制劑的免疫增強效應模型

參考文獻：

Lelliott Emily J., Kong Isabella Y., Zethoven Magnus., Ramsbottom Kelly M., Martelotto Luciano G., Meyran Deborah., Jiang Zhu Joe., Costacurta Matteo., Kirby Laura., Sandow Jarrod J., Lim Lydia., Dominguez Pilar M., Todorovski Izabela., Haynes Nicole M., Beavis Paul A., Neeson Paul J., Hawkins Edwin D., McArthur Grant A., Parish Ian A., Johnstone Ricky W., Oliaro Jane., Sheppard Karen E., Kearney Conor J., Vervoort Stephin J.(2021). CDK4/6 inhibition promotes anti-tumor immunity through the induction of T cell memory. Cancer Discov, undefined(undefined), undefined. doi:10.1158/2159-8290.CD-20-1554