CDK4/6抑制通過誘導(dǎo)T細(xì)胞記憶促進(jìn)抗腫瘤免疫

細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶4和6(CDK4/6)的藥理學(xué)抑制劑是激素受體陽(yáng)性乳腺癌的獲批治療藥物，目前正在其他癌癥類型的數(shù)百項(xiàng)臨床試驗(yàn)中進(jìn)行評(píng)價(jià)。這些抑制劑的臨床成功在很大程度上歸因于定義明確的腫瘤內(nèi)在細(xì)胞抑制機(jī)制，而其作為免疫調(diào)節(jié)劑的新作用知之甚少。本研究利用整合的表觀基因組、轉(zhuǎn)錄組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)分析，證明了CDK4/6抑制劑在促進(jìn)免疫T細(xì)胞記憶的表型和功能獲得中的新作用。本文的機(jī)制見解拓寬了CDK4/6抑制劑作為增強(qiáng)抗腫瘤T細(xì)胞免疫的臨床工具的前瞻性效用。本研究于2021年5月14日發(fā)表在《Cancer Discovery》IF:29.497期刊上。

技術(shù)路線：

主要實(shí)驗(yàn)結(jié)果：

1、在響應(yīng)CDK4/6抑制中瘤內(nèi)記憶類CD8+ T細(xì)胞的表現(xiàn)

為了全面評(píng)價(jià)CDK4/6抑制對(duì)抗腫瘤T細(xì)胞免疫的影響，使用多模式單細(xì)胞測(cè)序(CITE-seq)分析了CDK4/6抑制劑palbociclib或?qū)φ仗幚淼?/span>MC38-OVA腫瘤小鼠的瘤內(nèi)T細(xì)胞群體 (Fig. 1A)。維度分析顯示MC38-OVA腫瘤中有10個(gè)不同的T細(xì)胞群(Fig. 1B)。用CDK4/6i處理的腫瘤有較低頻率的CD4+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Foxp3+ Tregs)，而CD8+記憶類T細(xì)胞頻率更高，以Tcf7、Sell、Bcl2和Cd7高表達(dá)為特征(Fig. 1B-D)。CD8+ T細(xì)胞池的基因動(dòng)態(tài)表達(dá)揭示來源于CDK4/6i處理的小鼠的CD8+腫瘤免疫浸潤(rùn)（TILs）向更早、更像干細(xì)胞的分化狀態(tài)傾斜(Fig. 1E-F)。與此一致，較早出現(xiàn)假時(shí)間軌跡的細(xì)胞表達(dá)更高水平的記憶相關(guān)基因(Tcf7, Sell, Il7r)，和更低水平的效應(yīng)相關(guān)基因(Prf1, Gzmb)和耗損標(biāo)志物(PD-1, TIM3) (Fig. 1G)。支持了轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析，流式細(xì)胞術(shù)表明帶有中央記憶(Tcm)表型(CD44+CD62L+)的CD8+ TILs的比例顯著更高，這在不同的腫瘤模型中是一致的(Fig. 1H)。為了檢驗(yàn)抑制CDK4/6對(duì)抗腫瘤T細(xì)胞免疫的長(zhǎng)期功能效應(yīng)，用CDK4/6i在短時(shí)間 (抗腫瘤T細(xì)胞反應(yīng)最活躍的3-13天)處理MC38-OVA荷瘤小鼠，然后停藥。在停止治療時(shí)，CDK4/6i處理小鼠和對(duì)照小鼠的腫瘤體積是相等的(Fig. 1I-J)。引人注目的是，在停止治療后，既往使用CDK4/6i治療的小鼠中有21只小鼠腫瘤完全清除，而對(duì)照組只有9只(Fig. 1K)?？傊@些數(shù)據(jù)表明CDK4/6的藥理抑制促進(jìn)T細(xì)胞記憶，并產(chǎn)生能夠驅(qū)動(dòng)有效和持續(xù)的抗腫瘤反應(yīng)的瘤內(nèi)T細(xì)胞室。

圖1用CDK4/6抑制劑處理的小鼠出現(xiàn)瘤內(nèi)記憶類CD8+ T的細(xì)胞。

2、CDK4/6i介導(dǎo)的CD8+ T細(xì)胞記憶獲得是細(xì)胞固有的

為了確定在CDK4/6i處理的腫瘤中觀察到的T細(xì)胞記憶是否由于CDK4/6在這些細(xì)胞內(nèi)的直接抑制，在體外將活化的小鼠CD8+ T細(xì)胞暴露于CDK4/6i中，并監(jiān)測(cè)Tcm獲取和分裂數(shù)。激活CDK4/6i暴露0、24、72 h后，Tcm細(xì)胞平均分裂數(shù)減少，同時(shí)細(xì)胞比例增加，且呈劑量依賴性，僅在24 h內(nèi)發(fā)生(Fig. 2A)。這表明CDK4/6i不是簡(jiǎn)單地抑制分化，而是直接促進(jìn)記憶形成，表明細(xì)胞周期機(jī)制與分化之間存在方向性關(guān)系。通過3'RNA-seq進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，在CDK4/6i處理后，記憶相關(guān)轉(zhuǎn)錄本增加，GSEA分析證實(shí)了記憶相關(guān)特征的富集，以及細(xì)胞周期相關(guān)特征的減少，包括E2F靶點(diǎn)(Fig. 2B-E)。矛盾的是，CDK4/6抑制也誘導(dǎo)了效應(yīng)相關(guān)轉(zhuǎn)錄本，包括Gzma、Gzmc和Pdcd1 (Fig. 2B-C)，這與之前CDK4/6i促進(jìn)T細(xì)胞活化的報(bào)道一致。

基序分析發(fā)現(xiàn)E2F TF基序在乙酰化降低相關(guān)區(qū)域顯著富集，在T細(xì)胞記憶驅(qū)動(dòng)因子相關(guān)基序乙?；黾?，包括含叉頭框因子(Fig. 2F)。為了確定這些變化是否伴隨著對(duì)不同細(xì)胞狀態(tài)的長(zhǎng)期表觀遺傳影響，在CDK4/6抑制后對(duì)體外活化的T細(xì)胞進(jìn)行了ATAC-seq，觀察到染色質(zhì)開放性的整體降低，T細(xì)胞記憶相關(guān)基因區(qū)域的開放性增加，包括Tcf7、Ccr7和Sell (Fig. 2G)。為了解開CDK4/6抑制后記憶和效應(yīng)特征的明顯二分法，在暴露于CDK4/6i 24h后，對(duì)體外活化T細(xì)胞進(jìn)行了單細(xì)胞RNA-seq。該分析顯示存在CDK4/6i處理后改變的不同T細(xì)胞亞群，簇2、4、5和8增加，簇0減少，以及整體G1細(xì)胞周期停滯(Fig. 2H-I)。接下來對(duì)記憶和效應(yīng)基因標(biāo)記，并使用AUCell比較富集評(píng)分，確定細(xì)胞池中不同的記憶樣和效應(yīng)樣簇(Fig. 2J)。有趣的是，CDK4/6i處理后增加的細(xì)胞簇2和5是記憶樣細(xì)胞，8是效應(yīng)樣細(xì)胞，證明CDK4/6i抑制促進(jìn)異質(zhì)T細(xì)胞池中表型不同的亞群細(xì)胞的記憶分化，增強(qiáng)效應(yīng)功能。

圖2 CDK4/6i介導(dǎo)的CD8+ T細(xì)胞記憶獲得是細(xì)胞固有的

3、CDK4/6抑制劑促進(jìn)記憶形成通過RB介導(dǎo)的G1停滯

為了確定驅(qū)動(dòng)CDK4/6i誘導(dǎo)的記憶，對(duì)調(diào)節(jié)記憶標(biāo)記的基因CD62L (SELL)，進(jìn)行了全基因組CRISPR/Cas9篩選，用基因組范圍的sgRNA文庫(kù)轉(zhuǎn)導(dǎo)表達(dá)Cas9的Jurkat T細(xì)胞（CDK4/6抑制后上調(diào)CD62L），然后用CDK4/6i處理，并對(duì)未能上調(diào)CD62L的細(xì)胞進(jìn)行熒光激活細(xì)胞分選(Fig. 3A)。對(duì)分選群體進(jìn)行測(cè)序發(fā)現(xiàn)，靶向RB轉(zhuǎn)錄共抑制因子1(RB1)的sgRNA僅在處理?xiàng)l件下顯著富集(Fig. 3B)，暗示RB是CDK4/6i誘導(dǎo)CD62L上調(diào)所必須的。隨后對(duì)急性(2h)暴露于CDK4/6i后的Jurkat細(xì)胞和活化的原代小鼠CD8 + T細(xì)胞進(jìn)行了整體磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)分析(Fig. 3C)。在Jurkat和小鼠T細(xì)胞中檢測(cè)到多個(gè)肽上特異性磷酸化位點(diǎn)的顯著缺失，包括典型的CDK4/6靶標(biāo)RB和RBL 1/2 (Fig. 3D-F)。值得注意的是，RB在兩種細(xì)胞蛋白組學(xué)中重疊，并且是全基因組CRISPR/Cas9篩選最顯著的（Fig. 3B，3G），表明CDK4/6i介導(dǎo)的記憶形成是由RB介導(dǎo)。因此，靶向敲除RB1，可以消除CD62L的表達(dá)上調(diào)(Fig. 3H)。3’RNA-seq分析顯示RB缺失廢除了轉(zhuǎn)錄對(duì)CDK4/6i的響應(yīng)，包括SELL，其被CDK4/6i誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄改變被RB缺失所大幅度減弱了(Fig. 3I)。與此一致，靶向敲除RB1也廢除了激活的初級(jí)小鼠CD8+T細(xì)胞的Tcm形成(Fig. 3J)。

為了確定CDK4 /6i誘導(dǎo)的記憶形成是否通過細(xì)胞周期的RB介導(dǎo)的G1期阻滯，用G1阻滯劑處理細(xì)胞，胸腺嘧啶，通過阻止DNA合成和進(jìn)入S期，獨(dú)立于RB的誘導(dǎo)G1阻滯。結(jié)果顯示胸腺嘧啶處理的細(xì)胞表型復(fù)制了CDK4/6抑制，并在很大程度上挽救了Rb1 KO細(xì)胞中Tcm的形成(Fig. 3J) ，表明RB介導(dǎo)的G1阻滯本身有助于CDK4 /6i誘導(dǎo)的記憶分化。通過3'RNA-seq進(jìn)一步分析Rb1 KO細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)記憶相關(guān)基因下調(diào)和效應(yīng)標(biāo)記增加（圖3K-L），CDK4/6抑制后未能逆轉(zhuǎn)（圖3M-N）。這些結(jié)果表明CDK4/6i介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄重編程和記憶形成是通過RB依賴的G1細(xì)胞周期停滯和同時(shí)抑制CDK4/6信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。

圖3 CDK4/6抑制劑促進(jìn)記憶形成通過RB

4、CDK4/6預(yù)處理增強(qiáng)功能性記憶CD8+ T細(xì)胞的持久性

長(zhǎng)期生存能力是T細(xì)胞記憶的基本特征。為了確定CDK4/6i處理的細(xì)胞在體內(nèi)是否表現(xiàn)出優(yōu)越的存活率，將未處理和CDK4/6i預(yù)處理的體外活化CD45.1 OT-i T細(xì)胞轉(zhuǎn)移至同源CD45.2小鼠中，并通過流式細(xì)胞術(shù)評(píng)價(jià)其隨時(shí)間的持續(xù)性和表型（Fig. 4A）。在30天內(nèi)，在血液和脾臟中檢測(cè)到的預(yù)處理OT-I - T細(xì)胞的頻率明顯更高（Fig. 4B）。30天后，未處理和預(yù)處理的OT-I - T細(xì)胞在血液和脾臟中的表型持久性相似，都具有記憶前體的特征 (MPECs; KLRG1-CD127+) (Fig. 4C)。為了評(píng)價(jià)CDK4/6i處理細(xì)胞的記憶能力，將未處理或體外活化的CD45.1 OT-i T細(xì)胞中預(yù)處理的細(xì)胞再次轉(zhuǎn)移至同源CD45.2宿主中。30d后，分離出OT-ⅠT細(xì)胞，等量重新轉(zhuǎn)移到同時(shí)感染李斯特菌-OVA(LM-OVA)的新宿主中（Fig. 4D)。未處理和預(yù)處理的OT-I T細(xì)胞在LM-OVA感染后擴(kuò)增和分化，迅速獲得功能性、產(chǎn)生細(xì)胞因子的SLEC表型(KLRG1 + CD127-)（Fig. 4E-F）。這些表明CDK4/6抑制驅(qū)動(dòng)T細(xì)胞記憶的表型和功能獲得。

然后使用單細(xì)胞RNA-seq來描述移植后30天脾臟中存留的T細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄譜（Fig. 4G）。使用pseudobulk RNA-seq分析和預(yù)轉(zhuǎn)移體外培養(yǎng)的基因比較，生成了持續(xù)細(xì)胞的基因標(biāo)記，其標(biāo)志是記憶相關(guān)基因(Sell，Foxp1，Tcf7，Cd7，Il7r，Klf2，Ccl5)的高表達(dá)和效應(yīng)相關(guān)基因(Gzmd，Ifng，Prf1，Gzma，Gzmb)的低表達(dá)(Fig. 4H-I)。對(duì)先前的體外單細(xì)胞數(shù)據(jù)（Fig. 2H-J）的進(jìn)一步分析顯示，CDK4/6i處理后，具有這種持續(xù)性特征的細(xì)胞頻率從7.5%增加至26.8%（Fig. 4J-K）。這些數(shù)據(jù)表明，抑制CDK4/6促進(jìn)T細(xì)胞向真實(shí)的記憶表型分化，其特征是功能的長(zhǎng)期持久性。

圖4CDK4/6預(yù)處理增強(qiáng)功能性記憶CD8+ T細(xì)胞的持久性

5、CDK4/6預(yù)處理增強(qiáng)CAR-T細(xì)胞的持久性和有效性

接下來測(cè)試CDK4/6i處理是否會(huì)誘導(dǎo)嵌合抗原受體(CAR)-T細(xì)胞的記憶表型，并克服CAR-T細(xì)胞治療成功的兩大障礙：T細(xì)胞耗竭和缺乏持久性。通過臨床試驗(yàn)，以Lewis Y (LeY)抗原為靶點(diǎn)，制造了人類CAR-T細(xì)胞 (Fig. 5A)并發(fā)現(xiàn)暴露于CDK4/6i產(chǎn)生CD4+和CD8+干細(xì)胞記憶（Tscm）CAR-T細(xì)胞 (Fig. 5B)。CAR-T細(xì)胞的3’RNA-seq揭示CDK4/6抑制后記憶表達(dá)顯著改變，GSEA分析證實(shí)了記憶相對(duì)效應(yīng)信號(hào)的富集，并如預(yù)期E2F靶基因下調(diào) (Fig. 5C)。為了檢測(cè)在體內(nèi)的持久性，使用兩個(gè)獨(dú)立供體的PBMC生成的LeY CAR-T細(xì)胞用CDK4/6i預(yù)處理，并轉(zhuǎn)移到NSG小鼠中(Fig. 5D)。與未經(jīng)處理的對(duì)照組相比，觀察到在移植后的幾周內(nèi)，血液中CD8+和CD4+預(yù)處理的CAR-T細(xì)胞的頻率和數(shù)量顯著增加(Fig. 5E-F)。為了評(píng)估這些CAR-T細(xì)胞的功能性記憶能力，在CAR-T細(xì)胞轉(zhuǎn)移后30天用LeY + 卵巢癌細(xì)胞系OVCAR-3(Fig. 5D)處理小鼠，觀察到與未處理的CAR組相比，預(yù)處理的CAR-T細(xì)胞在小鼠血液中的擴(kuò)增顯著增加(Fig. 5G)。意味著先前接受過CAR-T細(xì)胞治療的小鼠的腫瘤控制顯著增強(qiáng)(Fig. 5H-I)。值得注意的是，第30天的腫瘤大小與腫瘤侵襲前血液中CD3+ T細(xì)胞的數(shù)量呈顯著負(fù)相關(guān)(Fig. 5J)，表明CDK4/6i處理的CAR-T細(xì)胞的持久性增強(qiáng)是驅(qū)動(dòng)腫瘤控制的關(guān)鍵因素。事實(shí)上，腫瘤接種后40天，接受預(yù)處理的CAR-T細(xì)胞的小鼠浸潤(rùn)CD4+和CD8+ CAR-T細(xì)胞的數(shù)量顯著增加(Fig. 5K)。接下來通過將未處理或預(yù)處理的抗LeY CAR-T細(xì)胞轉(zhuǎn)移到OVCAR-3荷瘤小鼠體內(nèi)，檢測(cè)了CDK4/6i預(yù)處理對(duì)CAR-T細(xì)胞急性療效的影響。用CDK4/6i預(yù)處理CAR-T細(xì)胞可顯著增強(qiáng)其抗腫瘤活性（Fig.5L-M)。與此一致，轉(zhuǎn)移后數(shù)周發(fā)現(xiàn)接受預(yù)處理細(xì)胞的小鼠血液中CD4 + 和CD8 + 細(xì)胞以及腫瘤中CD8 + 細(xì)胞數(shù)量顯著增高（Fig.5N-O)。總之，這些數(shù)據(jù)證明CDK4/6i體外治療是增強(qiáng)CAR-T細(xì)胞表型和長(zhǎng)期療效的穩(wěn)健策略。

圖5 CDK4/6預(yù)處理增強(qiáng)CAR-T細(xì)胞的持久性和有效性

6、CDK4/6抑制誘導(dǎo)T細(xì)胞表型與免疫檢查點(diǎn)封鎖的良好反應(yīng)相關(guān)

在臨床小鼠模型中，CDK4/6抑制劑與ICB顯示出顯著的協(xié)同作用。鑒于最近的研究強(qiáng)調(diào)腫瘤微環(huán)境中的干細(xì)胞樣T細(xì)胞是ICB反應(yīng)的關(guān)鍵介質(zhì)，作者假設(shè)CDK4/6i介導(dǎo)的T細(xì)胞記憶誘導(dǎo)產(chǎn)生了更有利的T細(xì)胞池用于免疫檢查點(diǎn)靶向治療，因此將有助于該聯(lián)合治療的療效。事實(shí)上，這種CDK4/6i應(yīng)答特征富集在ICB應(yīng)答患者的CD8 + TIL中，在單細(xì)胞和患者水平準(zhǔn)確分為應(yīng)答者和非應(yīng)答者（Fig.6A-D）。這表明CDK4/6i誘導(dǎo)了T細(xì)胞內(nèi)基因特征，該特征與患者對(duì)ICB的良好反應(yīng)相關(guān)。

作者收集并分析了黑色素瘤患者在治療過程中的連續(xù)血液樣本，在此期間，患者接受CDK4/6i聯(lián)合靶向MEK抑制劑治療，隨后接受PD-1和CTLA-4 ICB聯(lián)合治療（Fig.6 F），患者達(dá)到完全緩解。使用CITE-seq技術(shù)評(píng)估一系列患者樣本，觀察到CDK4/6i + MEKi治療后CD8 + T細(xì)胞記憶群的頻率呈時(shí)間依賴性增加，其特征為SELL、IL7R和TCF7的高表達(dá)（Fig.6G-I），這與臨床分析一致。事實(shí)上，偽時(shí)間分析揭示了從記憶樣群體到效應(yīng)細(xì)胞的分化軌跡，CDK4/6i在該軌跡早期抑制CD8 + T細(xì)胞，隨后的ICB治療加速了分化（Fig.6J）?？缭皆摃r(shí)間的TCR克隆追蹤也發(fā)現(xiàn)，CDK4/6抑制增加了罕見T細(xì)胞克隆的頻率，主要存在于記憶群體內(nèi)，隨后ICB處理擴(kuò)增了這些克?。?/span>Fig.6K）。這表明ICB治療釋放了外周血中更多種類T細(xì)胞受體。總之，這些數(shù)據(jù)表明，CDK4/6i可用作ICB給藥前促進(jìn)更有利T細(xì)胞表型的啟動(dòng)工具。

圖6 CDK4/6抑制誘導(dǎo)ICB響應(yīng)T細(xì)胞表型

這項(xiàng)研究證明了在細(xì)胞毒性T細(xì)胞中藥理學(xué)抑制CDK4/6可誘導(dǎo)RB介導(dǎo)的G1期阻滯，并促進(jìn)記憶表型的獲得，可顯著增強(qiáng)這些細(xì)胞的長(zhǎng)期抗腫瘤活性(Fig. 7)。

圖7 CD8+ T細(xì)胞CDK4/6抑制劑的免疫增強(qiáng)效應(yīng)模型

參考文獻(xiàn)：

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