NOX4與阿爾茨海默氏癥

氧化應(yīng)激與阿爾茨海默病(AD)的發(fā)病機(jī)制有關(guān)。線粒體功能障礙與AD期間神經(jīng)毒性中的氧化應(yīng)激和活性氧(ROS)有關(guān)。線粒體代謝受損與AD腦損傷中的線粒體功能障礙有關(guān)。雖然已確定NOX4在腦損傷中的作用，但NOX4調(diào)控AD中星形膠質(zhì)細(xì)胞鐵死亡的機(jī)制尚不清楚。因此，小編給大家介紹于2021年3月發(fā)表于影響因子為9.986的“Redox Biology”上的文章“NOX4 promotes ferroptosis of astrocytes by oxidative stress-induced lipid peroxidation via the impairment of mitochondrial metabolism in Alzheimer’s diseases”。我們的結(jié)果表明，NOX4通過脂質(zhì)過氧化損傷AD中線粒體代謝，促進(jìn)星形膠質(zhì)細(xì)胞的鐵死亡。

技術(shù)路線

結(jié)果

1）NOX4水平在阿爾茨海默病患者皮質(zhì)區(qū)受損星形膠質(zhì)細(xì)胞中升高

為了探討NOX4在AD患者星形膠質(zhì)細(xì)胞損傷中的作用，我們分析了AD患者大腦皮質(zhì)星形膠質(zhì)細(xì)胞中NOX4蛋白水平是否升高。我們采用免疫熒光染色法檢測(cè)AD患者或非AD供者(正常)顳葉皮質(zhì)組織GFAP陽性星形膠質(zhì)細(xì)胞中的NOX4蛋白水平(圖1 A和B)。免疫熒光染色顯示AD患者皮質(zhì)區(qū)分子層GFAP陽性星形膠質(zhì)細(xì)胞中NOX4陽性染色強(qiáng)度相對(duì)于非AD供者增加(圖1A)。此外，AD患者皮質(zhì)區(qū)ML中受損的GFAP陽性星形膠質(zhì)細(xì)胞中的NOX4陽性染色強(qiáng)度高于非AD供者(圖1 A和B)。值得注意的是，AD患者中NOX4與GFAP亞細(xì)胞共定位陽性的受損星形膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量顯著增加(圖1C)。與非AD供者相比，每一位AD患者的NOX4水平普遍較高。這些結(jié)果提示，AD患者星形膠質(zhì)細(xì)胞受損時(shí)NOX4蛋白水平升高。

2）阿爾茨海默病患者皮質(zhì)區(qū)受損星形膠質(zhì)細(xì)胞中氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的脂質(zhì)過氧化水平升高

由于NOX4蛋白水平在AD患者受損星形膠質(zhì)細(xì)胞中升高，我們研究NOX4在AD患者受損星形膠質(zhì)細(xì)胞氧化應(yīng)激中的作用。我們用免疫熒光染色法檢測(cè)了AD患者或非AD供者大腦顳葉皮質(zhì)組織中GFAP陽性星形膠質(zhì)細(xì)胞中4-HNE的蛋白水平(圖2A)。免疫熒光染色顯示，AD患者(AD)皮質(zhì)區(qū)分子層GFAP陽性星形膠質(zhì)細(xì)胞中4- HNE陽性染色強(qiáng)度相對(duì)于非AD供者增加(圖2A、B)。此外，AD患者皮質(zhì)區(qū)ML中受損的GFAP陽性星形膠質(zhì)細(xì)胞4-HNE陽性染色強(qiáng)度高于非AD供者(圖2A和B)。AD患者中4-HNE與GFAP亞細(xì)胞共定位陽性的受損星形膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量顯著增加(圖2C)。此外，相對(duì)于非AD供體，4-HNE在AD患者的NOX4陽性星形膠質(zhì)細(xì)胞中共定位(圖2D)。AD患者的NOX4和4-HNE陽性星形膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量相對(duì)于非AD供者顯著增加(圖2E)。這些結(jié)果提示AD患者受損星形膠質(zhì)細(xì)胞中氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的脂質(zhì)過氧化水平升高。

3）APP/PS1小鼠大腦皮質(zhì)區(qū)受損星形膠質(zhì)細(xì)胞中NOX4水平升高

我們研究了NOX4在APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因AD小鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞損傷中的作用。我們使用免疫熒光染色檢測(cè)APP/PS1小鼠和野生型小鼠皮質(zhì)GFAP陽性星形膠質(zhì)細(xì)胞中NOX4的蛋白水平。免疫熒光染色顯示，APP/PS1小鼠皮質(zhì)區(qū)GFAP陽性星形膠質(zhì)細(xì)胞中NOX4陽性染色強(qiáng)度高于WT小鼠(圖3A和B)。與WT小鼠相比，APP/PS1小鼠中NOX4與GFAP亞細(xì)胞共定位陽性的受損星形膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量顯著增加(圖3C)。這些結(jié)果提示APP/PS1小鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞受損時(shí)NOX4蛋白水平升高。

4）APP/PS1小鼠大腦皮質(zhì)區(qū)受損星形膠質(zhì)細(xì)胞中氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的脂質(zhì)過氧化水平升高

我們研究了NOX4來源的氧化應(yīng)激在APP/PS1小鼠受損星形膠質(zhì)細(xì)胞中的作用。我們用免疫熒光染色法測(cè)定了APP/PS1小鼠和野生型(WT)小鼠大腦皮層GFAP陽性星形膠質(zhì)細(xì)胞中4-HNE的蛋白水平(圖4A)。免疫熒光染色顯示，與WT小鼠相比，APP/PS1小鼠皮質(zhì)區(qū)GFAP陽性星形膠質(zhì)細(xì)胞中4- HNE陽性染色強(qiáng)度增加(圖4A、C)。APP/PS1小鼠皮質(zhì)區(qū)受損的GFAP陽性星形膠質(zhì)細(xì)胞中4- HNE陽性染色強(qiáng)度升高。此外，與WT小鼠相比，APP/PS1小鼠中4- HNE和GFAP亞細(xì)胞共定位呈陽性的受損星形膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量顯著增加(圖4D)。與WT小鼠相比，APP/PS1小鼠皮質(zhì)區(qū)GFAP陽性星形膠質(zhì)細(xì)胞(圖4B和E)和MDA與GFAP亞細(xì)胞共定位陽性的受損星形膠質(zhì)細(xì)胞(圖4F)數(shù)量增加。4-HNE在APP/PS1小鼠NOX4陽性星形膠質(zhì)細(xì)胞中共定位(圖4G)。此外，APP/PS1小鼠NOX4和4-HNE陽性星形膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量顯著增加(圖4H)。這些結(jié)果提示APP/PS1受損小鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞中氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的脂質(zhì)過氧化水平升高。

5）NOX4的升高通過抑制人類星形膠質(zhì)細(xì)胞線粒體呼吸和ATP的產(chǎn)生來促進(jìn)線粒體代謝的損傷，從而促進(jìn)氧化應(yīng)激

我們研究了AD期間NOX4升高誘導(dǎo)受損星形膠質(zhì)細(xì)胞氧化應(yīng)激的潛在分子機(jī)制。與對(duì)照組相比，NOX4過表達(dá)顯著抑制了OCR的基礎(chǔ)水平，且顯著降低了寡霉素和FCCP作用下的OCR水平(圖5A和B)。接下來，我們研究了NOX4上調(diào)對(duì)人類星形膠質(zhì)細(xì)胞線粒體呼吸途徑調(diào)控的分子靶點(diǎn)。我們分析了包括NADH在內(nèi)的5種線粒體ETC蛋白復(fù)合物的水平(圖5C)。與OCR水平一致，與對(duì)照組相比，NOX4過表達(dá)顯著抑制了5種線粒體氧化磷酸化酶復(fù)合物的蛋白水平并顯著減少ATP的產(chǎn)生(圖5D)。免疫熒光染色顯示，與對(duì)照組相比，NOX4的升高導(dǎo)致線粒體碎裂，并顯著增加了線粒體碎裂的細(xì)胞數(shù)量(圖5G)。這些結(jié)果表明，NOX4的升高通過抑制人類星形膠質(zhì)細(xì)胞線粒體呼吸和ATP的產(chǎn)生，從而損害線粒體代謝，從而促進(jìn)氧化應(yīng)激。

6）NOX4誘導(dǎo)的線粒體代謝損傷通過抑制人類星形膠質(zhì)細(xì)胞的細(xì)胞抗氧化過程而誘導(dǎo)氧化應(yīng)激

我們研究了NOX4誘導(dǎo)的線粒體代謝損傷是否可以通過抑制人體星形膠質(zhì)細(xì)胞的細(xì)胞抗氧化過程來誘導(dǎo)氧化應(yīng)激。與對(duì)照組相比，NOX4的升高顯著降低了谷胱甘肽(GSH)水平和谷胱甘肽/氧化谷胱甘肽(GSSG)的比值(圖6A和B)。NOX4的升高也增加了GSSG的水平(圖6C)。由于NOX4導(dǎo)致GSH減少以及GSH/ GSSG比值降低，我們接下來研究NOX4是否可以影響人類星形膠質(zhì)細(xì)胞中NRF2信號(hào)通路，這是細(xì)胞抗氧化反應(yīng)的關(guān)鍵調(diào)控因子。與對(duì)照組相比，NOX4的升高抑制了NRF2在細(xì)胞質(zhì)中的核易位(圖6D)。此外，NRF2靶基因HO-1和GCL的水平和活性在人星形膠質(zhì)細(xì)胞中被NOX4過表達(dá)顯著抑制(圖6E和F)。這些結(jié)果表明，NOX4誘導(dǎo)的線粒體代謝損傷通過抑制人星形膠質(zhì)細(xì)胞的細(xì)胞抗氧化過程而誘導(dǎo)氧化應(yīng)激。

7）NOX4通過氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的人體星形膠質(zhì)細(xì)胞的脂質(zhì)過氧化促進(jìn)鐵死亡

為了探討NOX4調(diào)控AD星形膠質(zhì)細(xì)胞氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡的分子機(jī)制，我們檢測(cè)NOX4的升高是否能通過氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的人星形膠質(zhì)細(xì)胞脂質(zhì)過氧化促進(jìn)鐵死亡。我們用免疫熒光染色法測(cè)定了4- HNE在人星形膠質(zhì)細(xì)胞中的蛋白水平。免疫熒光染色顯示，與對(duì)照組相比，NOX4的升高增加了4-HNE蛋白的水平，增加了質(zhì)膜中脂質(zhì)過氧化源性液滴的含量，細(xì)胞的形狀出現(xiàn)收縮(圖7A)。NOX4過表達(dá)使4- HNE陽性細(xì)胞數(shù)量顯著增加(圖7B)。NOX4過表達(dá)增加了4-HNE水平和MDA水平(圖7C)。值得注意的是，與對(duì)照組相比，NOX4的升高增加了鐵的積累，這是鐵死亡的特異性標(biāo)志(圖7D)。接下來，我們使用3D分析儀分析NOX4上調(diào)后人星形膠質(zhì)細(xì)胞細(xì)胞毒性的形態(tài)學(xué)變化(圖7E)。相對(duì)于對(duì)照，NOX4的升高誘導(dǎo)了細(xì)胞毒性的形態(tài)學(xué)特征，包括細(xì)胞質(zhì)面積縮小和起泡(圖7E)。此外，與對(duì)照組相比，NOX4升高后，形態(tài)死亡細(xì)胞數(shù)量顯著增加(圖7F)。與形態(tài)學(xué)分析結(jié)果一致，相對(duì)于對(duì)照，NOX4的升高顯著增加了細(xì)胞毒性水平(圖7G)。這些結(jié)果表明，NOX4通過氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的人星形膠質(zhì)細(xì)胞脂質(zhì)過氧化促進(jìn)了鐵死亡。

結(jié)論：NOX4通過線粒體代謝損傷，氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的脂質(zhì)過氧化作用促進(jìn)星形膠質(zhì)細(xì)胞的鐵死亡，這是AD期間星形膠質(zhì)細(xì)胞損傷的一種重要分子機(jī)制。