單細(xì)胞RNA和染色質(zhì)可及性研究揭示紊亂血流誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞的重編程

動(dòng)脈粥樣硬化是心肌梗死、缺血性中風(fēng)和外周動(dòng)脈疾病(PAD)的主要潛在原因，是世界范圍內(nèi)的主要死亡原因。動(dòng)脈粥樣硬化是一種慢性炎癥性疾病，優(yōu)先發(fā)生在暴露于紊亂血流(d-flow)的動(dòng)脈區(qū)域，而暴露于穩(wěn)定血流(s-flow)的動(dòng)脈區(qū)域則受到保護(hù)。血流被內(nèi)皮細(xì)胞(ECs)中的機(jī)械傳感器識(shí)別，進(jìn)而激活信號(hào)通路，導(dǎo)致基因表達(dá)、內(nèi)皮功能和動(dòng)脈粥樣硬化通路的調(diào)控。D-flow誘導(dǎo)ec中重要的原動(dòng)脈粥樣硬化通路，包括內(nèi)皮炎癥和功能障礙、滲透性功能障礙、血栓形成和內(nèi)皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(EndMT)。相反，s-flow保護(hù)ec免受這些原動(dòng)脈粥樣硬化途徑的影響。

了解流量調(diào)節(jié)內(nèi)皮基因的表達(dá)在轉(zhuǎn)錄和體內(nèi)外遺傳性染色質(zhì)易訪問性水平,我們和其他人使用批量rna或dna從池獲得ECs暴露s-flow或維使用鼠標(biāo)部分頸動(dòng)脈結(jié)扎(PCL)模型或豬動(dòng)脈。我們建立了PCL模型，并顯示在2周內(nèi)，d-flow快速誘導(dǎo)，而s-flow阻止，高膽固醇小鼠動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)展。PCL模型包括結(jié)扎左側(cè)頸總動(dòng)脈(LCA)的4個(gè)遠(yuǎn)端分支中的3個(gè)以誘導(dǎo)d-血流，同時(shí)使用繼續(xù)暴露于s-血流的對(duì)側(cè)右側(cè)頸總動(dòng)脈(RCA)作為內(nèi)部控制。我們進(jìn)一步開發(fā)了一種管腔沖洗方法，使我們能夠從PCL后的lca和rca中獲得內(nèi)皮富集的rna和dna。然后用mRNA微陣列、microRNA微陣列和RNA測序(RNA-seq)分析這些聚合的整體RNA，以識(shí)別mRNA轉(zhuǎn)錄組和受ECs流量調(diào)節(jié)的microRNAs。這些研究導(dǎo)致了大量的流動(dòng)敏感基因和microrna的發(fā)現(xiàn)，這些基因和microrna在內(nèi)皮生物學(xué)和動(dòng)脈粥樣硬化中的作用已經(jīng)被詳細(xì)描述和研究。我們還能夠從lca和rca中獲得大量DNA樣本，并通過減少代表性亞硫酸氫鹽測序(RRBS)方法進(jìn)行分析。本研究表明，d-flow和s-flow差異調(diào)控ECs的表觀基因組DNA甲基化譜，鑒定了許多受流量調(diào)控的基因位點(diǎn)。

雖然這些使用大量RNA和DNA樣本的轉(zhuǎn)錄組和表觀基因組甲基組研究清楚地確定了d-流和s-流對(duì)體內(nèi)ECs的差異影響，但這些研究的解釋有一些局限性。雖然我們的大塊RNA和DNA制劑中富含來自腔內(nèi)沖洗的ec，但不可避免的是它們包含了一些存在于內(nèi)膜中的其他細(xì)胞類型，尤其是PCL手術(shù)后的lca。例如，我們觀察到早在PCL后12小時(shí)，LCA樣本中與免疫細(xì)胞和間充質(zhì)細(xì)胞相關(guān)的許多基因的表達(dá)增加;然而，我們不能確定這些改變是由于非內(nèi)皮細(xì)胞浸潤內(nèi)膜所致，還是由于內(nèi)皮細(xì)胞的d-流所致。

2020年12月，埃默里大學(xué)在Cell Rep（IF=8.087） 雜志上發(fā)表了文章“Endothelial Reprogramming by Disturbed Flow Revealed by Single-Cell RNA and Chromatin Accessibility Study”。此報(bào)道在PCL后，使用從小鼠頸動(dòng)脈腔內(nèi)獲得的富含內(nèi)皮細(xì)胞的單細(xì)胞和細(xì)胞核進(jìn)行了scRNA-seq和scATAC-seq檢測，以確定d-flow和s-flow對(duì)基因轉(zhuǎn)錄本和染色質(zhì)可及性譜的基因組和表觀基因組調(diào)控的差異影響。對(duì)scRNA-seq和scATAC-seq數(shù)據(jù)的單獨(dú)分析以及對(duì)兩個(gè)數(shù)據(jù)集的綜合分析顯示，即使在s-flow下，頸動(dòng)脈內(nèi)的ECs也是異質(zhì)性的。D-flow顯著改變了內(nèi)皮轉(zhuǎn)錄組和表觀基因組譜，將它們重新編程為炎癥細(xì)胞、間充質(zhì)細(xì)胞、干細(xì)胞/祖細(xì)胞樣細(xì)胞、造血細(xì)胞和免疫細(xì)胞樣表型。此外，我們還發(fā)現(xiàn)了一種依賴于d-flow和s-flow的TF結(jié)合位點(diǎn)和順式調(diào)節(jié)元件的富集。

技術(shù)路線：

為了確定s-flow和d-flow在體內(nèi)單細(xì)胞分辨率下對(duì)ECs基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)和染色質(zhì)可及性譜的全基因組影響，我們使用小鼠PCL模型進(jìn)行了scRNA-seq和scATAC-seq。將C57BL/6小鼠部分結(jié)扎，以暴露于血流的對(duì)側(cè)RCA作為對(duì)照，在LCA中誘導(dǎo)d-血流。部分結(jié)扎后2天(2D)和2周(2W)， rca (2D- r和2W- r)和lca (2D- l和2W- l)用膠原酶酶解獲得單個(gè)細(xì)胞和單個(gè)核，分別用于scRNA-seq和scATAC-seq。

使用小鼠PCL模型進(jìn)行scRNA-Seq和scATAC-Seq分析

在標(biāo)準(zhǔn)化之后，一個(gè)基于無監(jiān)督圖的聚類將細(xì)胞劃分成組，通過統(tǒng)一流形近似和投影(UMAP)圖可視化(圖1A)。

我們的UMAP分析確定了16個(gè)獨(dú)特的細(xì)胞簇以流和時(shí)間依賴的方式分布(圖1A和1B)。每個(gè)細(xì)胞簇都是用確定的標(biāo)記基因進(jìn)行鑒定(1C).發(fā)現(xiàn)8個(gè)EC簇(E1 E8)、血管平滑肌細(xì)胞(SMCs)、成纖維細(xì)胞(Fibro)、4個(gè)單核/巨噬細(xì)胞(macrophages 1 4)、樹突狀細(xì)胞(DCs)和T細(xì)胞。通過Pecam1、Icam2、Cdh5和Tie1的表達(dá)來鑒定EC簇。smc特異性標(biāo)記為Cnn1、Myl9和Speg。同樣，Medag、Dpep1和Lum作為纖維的標(biāo)記物;巨噬細(xì)胞C1qa, C1qb, C1qc, C5ar1;DCs的Ccr7和Mmp25;T細(xì)胞的Itk(圖1C)。

在整個(gè)細(xì)胞群中，2D-R和2W-R樣本之間沒有明顯的差異，這表明暴露在s-flow條件下2天或2周的細(xì)胞基本沒有變化。S-flow條件下(2D-R和2W-R)很少發(fā)現(xiàn)SMC，而急性d-flow條件下(2D-L) SMC數(shù)量增加至2.3%，慢性d-flow條件下(2W-L) SMC數(shù)量進(jìn)一步增加至18.2%。四種情況下都有成纖維細(xì)胞，其中在急性d-flow情況下最多(2D-L時(shí)為17%)(圖1D)

對(duì)2D-R、2D-L、2W-R、2W-L 4個(gè)樣本的序列reads使用R軟件包進(jìn)行分析。UMAP分析將總核群劃分為13個(gè)細(xì)胞群，它們以流量和時(shí)間依賴的方式分布(圖1E和1F)。

通過Signac將scATAC-seq數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換為基因活性指數(shù)，并使用上述scRNA-seq研究中描述的相同標(biāo)記基因確定細(xì)胞身份。在13個(gè)簇中，8個(gè)是內(nèi)皮簇(E1 E8)，其次是SMCs、Fibro、巨噬細(xì)胞、dc、T細(xì)胞和未定義(ND)(圖1G)。

一、scRNA-Seq和scATAC-Seq的整合

共嵌入的UMAP圖顯示，scRNA-seq和scATAC-seq數(shù)據(jù)集中分析的大部分細(xì)胞相互重疊，這表明在大多數(shù)細(xì)胞簇中，染色質(zhì)可及性和相應(yīng)的基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)的變化是一致的(圖2A)。

整合結(jié)果顯示，兩個(gè)數(shù)據(jù)集中所有巨噬細(xì)胞簇幾乎完全重疊，表明我們的研究中確定的所有巨噬細(xì)胞簇沒有明確區(qū)分。scATAC-seq和scRNA-seq數(shù)據(jù)的單個(gè)UMAP圖顯示了各自的小區(qū)集群標(biāo)識(shí)(圖2B和2C)。然后使用每個(gè)細(xì)胞簇中前10個(gè)上調(diào)的基因生成熱圖(圖2D)。如圖2E所示，暴露于慢性d-流中的ec表現(xiàn)出許多與致動(dòng)脈粥樣硬化途徑相關(guān)的已知生物學(xué)過程的誘導(dǎo)。

二、偽時(shí)間軌跡，染色質(zhì)可及性和基因表達(dá)分析揭示Flow-Dependent內(nèi)皮細(xì)胞重新編程

我們的分析明確了3種主要的分化細(xì)胞類型:(1)ec，(2)免疫細(xì)胞(巨噬細(xì)胞，樹突狀細(xì)胞和T細(xì)胞)，以及(3)SMCs和纖維細(xì)胞(圖3A)。此外，在每一細(xì)胞類型走向的軌跡路徑上，還有許多其他細(xì)胞出現(xiàn)，表明它們響應(yīng)d-flow的過渡性去分化狀態(tài)。為了更好地理解軌跡結(jié)果，我們將分析分為四種實(shí)驗(yàn)條件(圖3B)。在s-flow條件下(2D-R和2W-R)，大部分細(xì)胞分化良好，少數(shù)細(xì)胞處于過渡狀態(tài)。相反，d-flow條件誘導(dǎo)許多ec進(jìn)入過渡狀態(tài)，潛在地向smc和纖維轉(zhuǎn)化分化，表明EndMT。令人驚訝的是，我們還發(fā)現(xiàn)許多ec在急性d-flow條件下(2D-L)向免疫細(xì)胞轉(zhuǎn)移，在慢性d-flow條件下(2W-L)進(jìn)一步增加。進(jìn)一步使用E8聚類分析顯示，這些暴露于慢性d-flow的ec向免疫細(xì)胞樣類型(EndICLT)轉(zhuǎn)變，但沒有達(dá)到完全分化的免疫細(xì)胞狀態(tài)(圖3C和S3)。圖3D顯示了EC簇中EndMT、Tagln、Acta2、Cnn1和Snai1的四個(gè)標(biāo)記物，分別代表了s流(E2)、急性d流(E6)和慢性d流(E8)染色質(zhì)可及性的變化。與s-流(E2)和急性d-流(E6)相比，慢性d-流在E8的啟動(dòng)子區(qū)域(箭頭)增加了這些基因的可及性。從scRNA-seq數(shù)據(jù)的小提琴圖中可以看出，E8中相應(yīng)基因的表達(dá)量增加，進(jìn)一步證實(shí)了這一結(jié)果(圖3E)。

如圖4所示，與LS相比，慢性O(shè)S降低了KLF2和KLF4的表達(dá)，同時(shí)誘導(dǎo)了EndMT標(biāo)記物(SNAI1和TAGLN)。重要的是，慢性O(shè)S誘導(dǎo)了兩個(gè)巨噬細(xì)胞標(biāo)記基因(C1QC和C5AR1)的表達(dá)，直接證明了OS可以在體外誘導(dǎo)EndICLT。此外，我們利用小鼠PCL模型進(jìn)行了一項(xiàng)en - face共免疫染色研究，以確定體內(nèi)CDH5+ ECs中是否表達(dá)巨噬細(xì)胞標(biāo)記蛋白。如圖4A-4D所示，C1QA和LYZ在LCA ECs中明顯被誘導(dǎo)，而在rca中沒有，這為血流誘導(dǎo)的eniclt提供了更有力的證據(jù)。我們分析了由基因本體結(jié)果確定的d-flow條件激活的致動(dòng)脈粥樣硬化通路(圖2E)。

如圖5所示，E8中的d-flow改變了白細(xì)胞流量和炎癥標(biāo)志物(Il1β、Il6、Ccl2和Ccl3);ECM調(diào)節(jié)(Adamts4, Lamb1, Timp3，和Timp4);血管調(diào)節(jié)(Nos3, Ptgs2，和Edn1);和脂質(zhì)代謝(Tm6sf2、Lsr和Mgll)，并與E2的s-flow進(jìn)行比較(圖5A-5D)。這些結(jié)果表明，d-flow激活了致動(dòng)脈粥樣硬化的內(nèi)皮反應(yīng)，同時(shí)通過改變轉(zhuǎn)錄和染色質(zhì)可及性水平上的基因表達(dá)來抑制抗動(dòng)脈粥樣硬化通路。

三、體內(nèi)血流依賴TF結(jié)合基序的鑒定

使用Signac和ChromVar軟件包通過我們的scATAC-seq數(shù)據(jù)集來識(shí)別流敏感的TF結(jié)合基序(圖6)。在每個(gè)內(nèi)皮聚類(E1- E8)中識(shí)別出前20個(gè)TF結(jié)合基序，并繪制成熱圖(圖6A)。圖6B和6C顯示了TF結(jié)合基序和它們被發(fā)現(xiàn)的各自的細(xì)胞簇。在s-flow條件下，KLF4的TF結(jié)合基元在E2中富集，而NRF1在E3和E4中富集(所有流條件下)(圖6B)。相比之下，暴露于d-flow條件下的E5 E8中，TEF、ETV3、RELA、FOS::JUN、TEAD1和STAT1的TF基序富集(圖6C)。對(duì)一些眾所周知的流量敏感tf的基模的鑒定，KLF4(與KLF2基模相同)，F(xiàn)OS:JUN (AP1)， RELA和TEAD1證實(shí)了我們分析的有效性。為了進(jìn)一步確定新發(fā)現(xiàn)的TF結(jié)合基序是否也與流量依賴反應(yīng)相關(guān)，我們檢測了phospho -STAT1水平是否對(duì)流量敏感，作為STAT1激活的標(biāo)記。pcl術(shù)后2周，與RCA相比，CDH5+ LCA的ECs中phosphoSTAT1水平顯著升高(圖6D和6E)。