在HER2陽性乳腺癌中，PTEN和ATM軸控制G1/S細胞周期檢查點和腫瘤發(fā)生

PTEN包含一個n端磷酸酶結(jié)構(gòu)域，它可以使脂質(zhì)細胞膜的一種成分——磷脂酰肌醇3,4,5-三磷酸(PI(3,4,5)P3或PIP3)去磷酸化。PTEN通過去磷酸化PIP3的D3位，拮抗磷脂酰肌苷3-激酶(PI3K)通路。PI3K通路調(diào)節(jié)多種細胞過程，包括細胞代謝、存活、增殖、凋亡、生長和遷移。這些基本的細胞過程，當(dāng)解除控制時，可以促進或驅(qū)動惡性表型。

PTEN功能突變的體細胞丟失在多種人類癌癥中被發(fā)現(xiàn)，包括乳腺癌、子宮內(nèi)膜癌、多形性膠質(zhì)母細胞瘤、皮膚癌和前列腺癌。PTEN缺失是乳腺癌中常見的事件，與加速進展和不良預(yù)后密切相關(guān)。特別是PTEN的表達已經(jīng)被提出在人表皮生長因子受體2 (HER2)過表達乳腺癌中發(fā)揮重要作用。HER2是表皮生長因子受體家族的一員，具有酪氨酸激酶活性。它的過表達，在大約15 - 20%的乳腺癌病例中觀察到，與侵襲性臨床行為和不良預(yù)后相關(guān)。曲妥珠單抗是一種與HER2胞外結(jié)構(gòu)域具有高親和力的單克隆抗體，是一種有效的治療HER2陽性乳腺癌患者的方法。PTEN表達檢測的總有效率約為70%，而PTEN表達陰性患者的總有效率僅為20%。

PTEN功能的喪失通常與基因組的不穩(wěn)定性有關(guān)。此外，小鼠胚胎成纖維細胞(mef)中PTEN基因的缺失導(dǎo)致了未修復(fù)的DNA雙鏈斷裂的積累。PTEN缺失被認為通過至少兩種分子機制促進了基因組的完整性。在細胞核中，PTEN與著絲粒結(jié)合蛋白CENP-C結(jié)合，促進著絲粒組裝和中期到后期的轉(zhuǎn)變。此外，作為轉(zhuǎn)錄因子E2F1的輔助因子，核PTEN似乎調(diào)節(jié)Rad51的表達，Rad51是DNA修復(fù)機制的關(guān)鍵組成部分。然而，后續(xù)的研究得出了不一致的結(jié)果，表明PTEN在轉(zhuǎn)錄水平上對RAD51的調(diào)控可能僅限于特定的細胞環(huán)境。

PTEN缺陷改變了多個細胞周期檢查點，可能留下更少的時間進行DNA損傷修復(fù)和/或染色體分離。細胞周期的進展需要幾個分子過程的完美執(zhí)行，以確保一個熟練的，無錯誤的，細胞分裂。這些事件發(fā)生的速度由周期蛋白依賴激酶(CDKs)的活性決定，CDKs磷酸化關(guān)鍵底物以促進DNA合成和有絲分裂進程。CDKs的催化活性受細胞周期檢查點的調(diào)控，這些檢查點監(jiān)測細胞周期中主要事件的有序執(zhí)行。檢查點代表了故障安全機制，它確保只有在滿足的最佳情況下才允許細胞分裂。所有生物體都需要通過細胞分裂周期進行適當(dāng)?shù)幕蚪M維護，以確保正常生殖、發(fā)育和預(yù)防包括癌癥在內(nèi)的各種疾病。DNA損傷可由內(nèi)源性過程引起，如DNA復(fù)制過程中偶爾引入的DNA不匹配，拓撲異構(gòu)酶I和拓撲異構(gòu)酶II活性失效導(dǎo)致的DNA鏈斷裂，或由正常代謝副產(chǎn)品產(chǎn)生的ROS攻擊DNA。外源性來源主要包括誘變化學(xué)品、紫外線和電離輻射(IR)。細胞周期檢查點能夠檢測DNA損傷，提示其存在，并激活延緩細胞周期進程的通路，修復(fù)DNA損傷，或通過誘導(dǎo)細胞死亡來消除基因不穩(wěn)定細胞。

哺乳動物細胞DNA損傷反應(yīng)(DDR)信號的核心是共濟失調(diào)毛細血管擴張癥突變(ATM)和ATM-和rad3相關(guān)(ATR)蛋白激酶。ATM和ATR磷酸化并激活另外兩個激酶CHK1和CHK2, CHK1和CHK2與ATM和ATR一起，是細胞周期檢查點[24]的主調(diào)節(jié)器。通過調(diào)節(jié)CDKs的活性，這些分子在細胞周期G1 S期、S內(nèi)期和G2 M期減緩或阻止細胞周期進程，使DNA損傷得以修復(fù)。ATM和ATR通過控制不同因子在DNA損傷位點的表達、活性或招募來促進DNA修復(fù)。一般來說，DDR機制能夠修復(fù)細胞在其生命周期中積累的DNA損傷，但如果認為損傷程度過高，就會誘導(dǎo)細胞凋亡或細胞衰老導(dǎo)致細胞死亡。

2021年4月，加拿大University Ave和中國香港大學(xué)團隊與癌癥研究所表觀遺傳學(xué)和基因組穩(wěn)定性小組在Cell Death & Differentiation 雜志上發(fā)表了文章“The PTEN and ATM axis controls the G1/S cell cycle checkpoint  and tumorigenesis in HER2-positive breast cancer”。此報道發(fā)現(xiàn)ATM磷酸化PTEN的398位(人類蘇氨酸;在小鼠絲氨酸)的激活，為了理解ATM磷酸化PTEN的生物學(xué)意義，建立了一個小鼠模型，構(gòu)建了一個不能被ATM磷酸化的PTEN突變形式，用398位(PTEN- 398a)的絲氨酸取代了丙氨酸。PTEN-398A的表達可加速her2陽性乳腺癌小鼠模型的腫瘤發(fā)展和進展。利用分子生物學(xué)方法，發(fā)現(xiàn)了一種新的機制，通過ATM磷酸化PTEN調(diào)節(jié)其細胞再分配，并有助于該蛋白的腫瘤抑制功能。

技術(shù)路線：

一、Pten398A加速MMTVneu驅(qū)動的乳腺腫瘤發(fā)生

為了研究ATM磷酸化PTEN的體內(nèi)功能，我們在小鼠中設(shè)計了一個敲入等位基因，其中398位絲氨酸取代了丙氨酸(Pten398A)。Pten398A/+和Pten398A/398A小鼠存活，發(fā)育明顯正常。為了研究atm依賴的PTEN磷酸化在乳腺癌中的可能作用，我們在小鼠乳腺腫瘤病毒(MMTV)啟動子/增強子轉(zhuǎn)錄控制下表達滅活neu (Erbb2)融合基因的小鼠背景下培養(yǎng)了Pten398A等位基因。在這個成熟的模型中，MMTVneu基因在正常乳腺上皮中低水平表達，導(dǎo)致乳腺腫瘤的發(fā)展，據(jù)報道中位發(fā)生率為205天。Pten+/+;MMTVneu小鼠發(fā)生了預(yù)期潛伏期的乳腺腫瘤，顯示了233天的中位生存期(圖1A)。相比之下，Pten398A/398A;MMTVneu小鼠腫瘤發(fā)展加快，中位生存期縮短至199天(圖1A)。對Pten+/+;MMTVneu和Pten398A/398A;MMTVneu小鼠的石蠟包埋腫瘤標本進行免疫組化檢測γH2AX。采用半定量方法對γH2AX免疫反應(yīng)性進行評分(表1)。Pten+/+;MMTVneu腫瘤一般很少表達γH2AX(圖1B)。所有Pten398A/398A;MMTVneu樣本均為γH2AX強陽性，表明更高水平的基因組不穩(wěn)定性(圖1B, C)。我們通過對腫瘤樣本的western blot分析證實了這些結(jié)果，結(jié)果顯示Pten398A/398A;MMTVneu腫瘤比Pten+/+;MMTVneu腫瘤表達更高水平的γH2AX(圖1D, E)。通過對Ki-67進行免疫組化來評估腫瘤的增殖指數(shù)，Ki-67是常規(guī)病理中廣泛使用的標志物。兩種基因型Pten+/+腫瘤的Ki67免疫反應(yīng)性無顯著差異;MMTVneu(補充圖2C, D)。總之，Pten398A突變加速mmtv神經(jīng)驅(qū)動的腫瘤發(fā)生，這與更高的基因組不穩(wěn)定性有關(guān)，但在細胞增殖中沒有明顯的改變。

二、阻斷atm依賴的PTEN磷酸化導(dǎo)致基因組

為了確定ATM介導(dǎo)的PTEN磷酸化如何調(diào)節(jié)DDR，構(gòu)建Pten398A/398A和Pten+/+ littermates MEFs細胞模型。PTEN蛋白水平不受398A突變的影響(補充圖3A, B)。此外，磷酸化AKT (PI3K通路活性的標記物)水平在Pten398A/398A和PTEN +/+ MEFs中相似(補充圖3B)。構(gòu)建人乳腺上皮細胞系(MCF10A)，穩(wěn)定表達野生型PTEN (PTEN- wt)，或PTEN的突變形式，不能被ATM磷酸化(PTEN- 398a)。在這些細胞中，內(nèi)源性的PTEN基因被CRISPR/Cas9編輯刪除，創(chuàng)建了PTEN空細胞，然后用野生型或突變型的蛋白質(zhì)穩(wěn)定轉(zhuǎn)導(dǎo)重組。在表達PTEN- wt和PTEN- 398a的MCF10A細胞中，PTEN蛋白和磷酸化AKT水平相似(補充圖3A)，使這些細胞成為ATM磷酸化PTEN分子作用研究的合適替代模型。

Pten+/+和Pten398A/398A mef在10gy IR作用下，通過測定每個細胞的γH2AX和53bp1病灶數(shù)量來評估其修復(fù)DNA損傷的能力。在Pten+/+ mef中，我們觀察到在照射后4小時，每個細胞的病灶數(shù)量達到峰值，24小時后恢復(fù)到接近基線水平(圖2A C)。Pten+/+和Pten398A/398A在ir后4小時，每個細胞聚集的病灶數(shù)量相似。然而，Pten398A/398A mef在24小時時間點比Pten+/+ mef保留了更多的病灶數(shù)，表明DNA修復(fù)能力降低(圖2 C)。

三、pten - s38a突變誘導(dǎo)細胞凋亡抵抗

為了進一步了解阻斷atm依賴的PTEN磷酸化如何影響細胞對基因毒性損傷的反應(yīng)，我們使用抗體陣列評估了表達PTEN- wt或PTEN- 398a的MCF10A細胞裂解液的應(yīng)激反應(yīng)和凋亡通路的活性。Pten+/+和Pten398A/398A MEF培養(yǎng)，表達Pten - wt的MCF10A細胞與表達Pten -398A的MCF10A細胞在正常培養(yǎng)條件下的生長速率均無差異(圖3A和補充圖5C)。對細胞進行不同的基因毒性脅迫處理:IR、順鉑和柔紅霉素。在所有條件下，Pten398A/398A MEFs和PTEN-398A表達的MCF10A細胞對基因毒性脅迫的抗性均高于野生型PTEN的細胞(圖3B D和Supplementary Fig. 5D, E)。通過流式細胞儀Annexin V染色判斷(圖3E)。通過使用caspase-3抗體對Pten+/+、MMTVneu和Pten398A/398A、MMTVneu腫瘤進行免疫組化染色，證實了這些觀察結(jié)果。caspase-3抗體是一種廣泛用于檢測凋亡細胞的標志物。確實，MMTVneu腫瘤的caspase-3陽性細胞比相應(yīng)的Pten+/+少;綜上所述，這些結(jié)果表明，PTEN不能被ATM磷酸化的細胞對基因毒性應(yīng)激誘導(dǎo)的細胞凋亡具有抗性。為了評估表達PTEN-398A且DNA損傷未解決的細胞在輻照(圖2B, C和補充圖4B, C)后的持續(xù)存在是否是誘導(dǎo)凋亡反應(yīng)失敗的結(jié)果，我們在IR之前先用泛caspase抑制劑z-VAD-FMK (zVAD)對細胞進行預(yù)處理。與DMSO處理相比，zVAD增加了PTEN-WT細胞中未解決的DNA損傷灶的數(shù)量，其水平與DMSO處理的PTEN-398A細胞相當(dāng)(補充圖5F)。然而，需要注意的是，zVAD預(yù)處理也略微增加了IR后PTEN-398A細胞中未解決的DNA損傷灶的數(shù)量。

四、atm依賴性PTEN磷酸化缺失的細胞中G1/S細胞周期檢查點受損

對表達PTEN-WT或PTEN-398A的MCF10A細胞進行了cDNA微陣列分析，并用順鉑誘導(dǎo)基因毒性應(yīng)激。差異表達基因列表采用基因集合富集分析[39]進行分析。有趣的是，表達PTEN- 398A的細胞中上調(diào)的基因與G1/S檢查點的激活有關(guān)，如G1/S期特異性轉(zhuǎn)錄、E2F靶標、Rb1通路控制的細胞周期調(diào)控基因等推測表達PTEN-398A的細胞對基因毒性脅迫的抗性可能是由于未能阻止細胞周期以應(yīng)對DNA損傷。為了測試這種可能性，測量了表達野生型或突變PTEN的同步細胞在細胞周期阻滯在G1/ S檢查點的能力，以應(yīng)對DNA損傷。在表達PTEN-WT或PTEN-398A的正常周期細胞中，G1、S、G2/M期細胞比例沒有明顯差異(圖4A)。為了使細胞在G1/S檢查點同步，我們對它們施加雙胸腺嘧啶脈沖。這種處理有效地抑制了PTEN-WT和PTEN-398A細胞在G1/S邊界(圖4B)。然后在正常生長培養(yǎng)基中釋放細胞，在S期進展期間用IR處理，6小時后收集細胞，用流式細胞術(shù)分析細胞周期分布(實驗方案見補充圖7A)。大部分PTEN-WT細胞被阻滯在s期，而PTEN-398A細胞未能阻滯細胞周期，而是發(fā)展到G2/M期(圖4C)。通過測定表達磷酸化組蛋白H3 (Ser10)的細胞比例，證實了這一觀察結(jié)果。磷酸化組蛋白H3 (Ser10)標志著細胞處于有絲分裂階段。(圖4 d)。

表達PTENWT的細胞，在雙胸苷激酶阻斷和輻射釋放后被阻滯在S期，表現(xiàn)出低水平的CDK2磷酸化(圖5A)。相反，經(jīng)過相同處理的PTEN-398A細胞有更高水平的磷酸化CDK2(圖5A)，這與DNA損傷檢查點的缺陷激活一致。與PTEN-WT細胞相比，PTEN-398細胞中磷酸化的AKT和磷酸化的p27Kip1水平更高(圖5B)。雖然p27Kip1與CDK2和Cyclin E在照射過的PTEN-WT細胞中有效地共免疫沉淀，但在PTEN-398A細胞中這些相互作用減弱(圖5C, D)。與我們在MCF10A細胞中觀察到的結(jié)果一致，免疫印跡分析顯示PTEN398A/398A裂解物中磷酸化的AKT和磷酸化的p27Kip1水平更高;MMTVNeu腫瘤與Pten+/+;MMTVNeu對應(yīng)腫瘤進行比較(圖5E-H)。總之，抑制ATM對PTEN的磷酸化增加了DNA損傷后AKT和p27Kip1的激活，反過來有利于CDK2/Cyclin E復(fù)合物的活性，并驅(qū)動細胞周期進程。

五、阻斷atm依賴的磷酸化會損害DNA損傷后PTEN的亞細胞再分配

研究了磷脂酰肌醇3,4,5磷酸(PIP3)在DNA損傷后的細胞定位。將MCF10A細胞按上述方法同步輻照，免疫熒光法分析PTEN的亞細胞分布。PTEN-WT和PTEN-398A蛋白在細胞核和質(zhì)膜穩(wěn)定定位(圖6A, B)。經(jīng)過IR處理后，PTEN-WT在質(zhì)膜上積累(圖6A, B)。相比之下，在這些條件下，沒有檢測到PTEN-398A蛋白的重新定位(圖6A, B)。B).我們通過細胞分離和膜相關(guān)PTEN的免疫印跡分析進一步證實了這些結(jié)果(圖6C, D)。這些結(jié)果表明，ATM對PTEN的磷酸化導(dǎo)致PTEN在質(zhì)膜上重新分布，這與AKT通路激活減少有關(guān)。