FOXO3A誘導(dǎo)的LINC00926抑制乳腺腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移

磷酸甘油酸激酶1 (PGK1)是糖酵解途徑的重要組成部分，與多種癌癥的發(fā)生發(fā)展有關(guān)。然而，PGK1抑制劑在癌細(xì)胞中的抑制機(jī)制和生理意義尚不清楚。因此，今天給大家介紹于2021年4月發(fā)表于“Molecular Therapy”（IF=8.986）的文章“FOXO3A-induced LINC00926 suppresses breast tumor growth and metastasis through inhibition of PGK1-mediated Warburg effect”。在這里，我們鑒定了一個(gè)負(fù)調(diào)控PGK1表達(dá)的lncRNA LINC00926，并預(yù)測(cè)乳腺癌良好的臨床預(yù)后。我們的研究建立了FOXO3A/LINC00926/PGK1作為調(diào)節(jié)乳腺癌生長(zhǎng)和進(jìn)展的關(guān)鍵軸。靶向PGK1或補(bǔ)充LINC00926或FOXO3A可能是乳腺癌的潛在治療策略。

技術(shù)路線

結(jié)果

1）LINC00926被篩選為PGK1負(fù)調(diào)控的lncRNA，與乳腺癌臨床結(jié)果相關(guān)

為了探索負(fù)調(diào)控PGK1的lncRNAs，我們根據(jù)圖1A所示的篩選策略對(duì)乳腺癌的三個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行了分析。我們鑒定了3個(gè)lncRNA，LINC00926，LINC01089和LINC00324與PGK1呈負(fù)相關(guān)，且表現(xiàn)出良好的臨床結(jié)果(圖1B-1D)。為了研究鑒定出的lncRNAs是否下調(diào)了PGK1的表達(dá)，我們分別用這三個(gè)lncRNAs分別轉(zhuǎn)染了乳腺癌細(xì)胞。我們的結(jié)果表明，在mRNA水平不變的情況下，只有LINC00926導(dǎo)致MCF-7和MDA-MB-231細(xì)胞中PGK1蛋白水平顯著下降(圖1E)，表明LINC00926下調(diào)了乳腺癌細(xì)胞中PGK1的表達(dá)。此外，與非腫瘤組相比，13/14(92.9%)例乳腺癌患者的LINC00926表達(dá)降低，12/14(85.7%)例乳腺癌患者的PGK1表達(dá)上調(diào)。在乳腺癌樣本中，LINC00926的表達(dá)與PGK1的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)(圖1 F)。有趣的是，我們發(fā)現(xiàn)內(nèi)源性PGK1蛋白水平和LINC00926水平在5種乳腺癌細(xì)胞系(MCF-7、T47D、ZR75-1、MDA-MB-453、MDA-MB-231)中均呈負(fù)表達(dá)。在相對(duì)轉(zhuǎn)移性細(xì)胞系MDA-MB-231中PGK1表達(dá)量最高，LINC00926表達(dá)量最低；而惡性程度較低的細(xì)胞系MCF-7中PGK1表達(dá)量較低，LINC00926表達(dá)量較高(圖1G)。敲除LINC00926后，MCF-7細(xì)胞中PGK1的表達(dá)顯著增加，而過(guò)表達(dá)LINC00926后，MDA-MB-231細(xì)胞中PGK1的表達(dá)顯著降低(圖1H)。這些結(jié)果表明，LINC00926下調(diào)PGK1的表達(dá)，可能與PGK1介導(dǎo)的乳腺癌發(fā)展呈負(fù)相關(guān)。

2）LINC00926通過(guò)抑制乳腺癌細(xì)胞中PGK1的表達(dá)來(lái)抑制增殖、遷移和侵襲

為了研究LINC00926在乳腺癌細(xì)胞中的生物學(xué)功能，我們用LINC00926感染細(xì)胞，對(duì)其進(jìn)行細(xì)胞生長(zhǎng)、遷移和侵襲分析。細(xì)胞增殖和集落形成實(shí)驗(yàn)顯示，過(guò)表達(dá)LINC00926可降低MDA-MB-231和MCF-7細(xì)胞的增殖(圖2A和2B)。在LINC00926轉(zhuǎn)染的細(xì)胞系中，PGK1的表達(dá)可逆轉(zhuǎn)上述作用。過(guò)表達(dá)LINC00926也顯示出遷移和侵襲能力下降(圖2C和2D)。同樣，PGK1在LINC00926轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中重新表達(dá)逆轉(zhuǎn)了這些作用。此外，敲除PGK1還可以抑制LINC00926調(diào)控乳腺癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的能力(圖2E-2H)，表示LINC00926通過(guò)抑制PGK1的表達(dá)來(lái)抑制乳腺癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲。

3）LINC00926通過(guò)抑制乳腺癌細(xì)胞中PGK1的表達(dá)來(lái)抑制糖酵解

由于PGK1是一種關(guān)鍵的糖酵解酶，而LINC00926被鑒定為負(fù)調(diào)控PGK1的lncRNA，我們想知道需氧糖酵解是否在LINC00926介導(dǎo)的乳腺癌細(xì)胞增殖抑制中發(fā)揮作用。我們測(cè)試了LINC00926對(duì)葡萄糖攝取、乳酸生成和ATP生成的調(diào)節(jié)作用。結(jié)果表明，LINC00926降低了葡萄糖攝取、乳酸生成和ATP生成(圖3A)。在LINC00926轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中，PGK1的表達(dá)逆轉(zhuǎn)了這些作用。LINC00926還顯示出細(xì)胞外酸化率下降(圖3B和3C)。PGK1在LINC00926轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中重新表達(dá)挽救了這些效果。在PGK1敲低的MDA-MB-231或MCF-7細(xì)胞中敲低LINC00926對(duì)糖酵解表型沒(méi)有影響(圖3D-3F)，表明LINC00926通過(guò)PGK1抑制糖酵解表型。綜上所述，LINC00926通過(guò)抑制乳腺癌細(xì)胞中PGK1的表達(dá)來(lái)抑制糖酵解。

4）LINC00926通過(guò)增強(qiáng)STUB1介導(dǎo)的泛素-蛋白酶體途徑調(diào)節(jié)PGK1蛋白的穩(wěn)定性

亞細(xì)胞定位結(jié)果顯示，LINC00926主要定位于細(xì)胞質(zhì)，F(xiàn)ISH實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)了這一點(diǎn)(圖4A和4B)。結(jié)合LINC00926沒(méi)有改變PGK1 mRNA水平的事實(shí)，我們推測(cè)LINC00926在轉(zhuǎn)錄后水平下調(diào)了PGK1的表達(dá)。事實(shí)上，蛋白酶體抑制劑MG132的加入阻斷了LINC00926過(guò)表達(dá)介導(dǎo)的PGK1降解，這表明泛素-蛋白酶體途徑參與了LINC00926對(duì)PGK1蛋白穩(wěn)定性的調(diào)節(jié)(圖4C)。LINC00926過(guò)表達(dá)增加PGK1泛素化(圖4D)。下調(diào)LINC00926基因后，PGK1蛋白水平升高，泛素化水平降低(圖4E)。為了尋找負(fù)責(zé)LINC00926調(diào)控PGK1蛋白穩(wěn)定性的E3泛素連接酶STUB1，我們接下來(lái)通過(guò)RNA下拉實(shí)驗(yàn)確定了LINC00926在乳腺癌細(xì)胞中的蛋白伴侶。質(zhì)譜分析結(jié)果顯示了特異性差異表達(dá)譜帶。我們鑒定出了幾個(gè)可能與LINC00926相互作用的蛋白，包括兩個(gè)E3連接酶，STUB1和E6AP(圖4F)。免疫印跡進(jìn)一步證實(shí)，只有STUB1與LINC00926相互作用，而E6AP則沒(méi)有(圖4G)。此外，RIP分析也表明，PGK1和STUB1免疫沉淀中，LINC00926顯著富集(圖4H)。此外，LINC00926增強(qiáng)了STUB1介導(dǎo)的PGK1泛素化(圖4I)。敲低STUB1大大減弱了LINC00926對(duì)PGK1泛素化的影響(圖4J)。這些數(shù)據(jù)表明，STUB1在LINC00926調(diào)控PGK1泛素化過(guò)程中起著關(guān)鍵作用。與LINC00926對(duì)STUB1介導(dǎo)的PGK1泛素化的影響一致，LINC00926增加了STUB1和PGK1之間的相互作用(圖4K)。而敲低STUB1大大減弱了LINC00926對(duì)PGK1降解的影響(圖4L)。

5）缺氧主要通過(guò)FOXO3A轉(zhuǎn)錄抑制LINC00926的表達(dá)，激活PGK1的表達(dá)

由于缺氧是癌癥的一個(gè)關(guān)鍵現(xiàn)象，我們確定了LINC00926/PGK1軸是否在缺氧下糖酵解的調(diào)節(jié)中發(fā)揮作用。缺氧刺激了PGK1在mRNA和蛋白水平上的表達(dá)，并降低了LINC00926的表達(dá)(圖5A)。為了確定缺氧如何抑制乳腺癌細(xì)胞中LINC00926的表達(dá)，我們研究了缺氧后對(duì)LINC00926啟動(dòng)子的抑制。對(duì)不同的LINC00926啟動(dòng)子缺失報(bào)告基因的分析顯示，啟動(dòng)子區(qū)域在300 - 200 bp之間包含一個(gè)缺氧抑制元件(圖5B)。該區(qū)域假定的FOXO3A結(jié)合位點(diǎn)的突變會(huì)導(dǎo)致抑制的喪失。在常氧或缺氧條件下，F(xiàn)OXO3A影響LINC00926和PGK1的表達(dá)，說(shuō)明FOXO3A是LINC00926調(diào)控的特異性轉(zhuǎn)錄因子(圖5C和5D)。ChIP分析表明，在常氧條件下，F(xiàn)OXO3A被募集到LINC00926啟動(dòng)子內(nèi)包含F(xiàn)OXO3A結(jié)合位點(diǎn)的區(qū)域，但沒(méi)有被募集到LINC00926啟動(dòng)子上游的區(qū)域，在缺氧條件下募集減少(圖5E)。FOXO3A提高了LINC00926水平，降低了PGK1水平，而且重要的是，在正常或缺氧條件下，下調(diào)LINC00926均嚴(yán)重?fù)p害了FOXO3A調(diào)節(jié)LINC00926和PGK1表達(dá)的能力(圖5F)。此外，敲除LINC00926還大大削弱了缺氧對(duì)PGK1上調(diào)的影響。這些數(shù)據(jù)表明，缺氧主要通過(guò)FOXO3A轉(zhuǎn)錄抑制LINC00926的表達(dá)，激活PGK1的表達(dá)。

6）FOXO3A通過(guò)調(diào)控乳腺癌細(xì)胞中LINC00926的表達(dá)抑制增殖、遷移和侵襲，抑制糖酵解

我們研究了FOXO3A是否通過(guò)LINC00926調(diào)節(jié)這些效應(yīng)。細(xì)胞增殖和集落形成分析顯示FOXO3A過(guò)表達(dá)抑制了乳腺癌細(xì)胞的生長(zhǎng)，而LINC00926敲低則促進(jìn)了細(xì)胞的生長(zhǎng)(圖6A和6B)。重要的是，下調(diào)LINC00926顯著減弱了FOXO3A調(diào)控細(xì)胞增殖的能力，表明FOXO3A主要通過(guò)表達(dá)LINC00926來(lái)降低乳腺癌細(xì)胞的增殖。接下來(lái)，我們通過(guò)LINC00926檢測(cè)FOXO3A是否抑制細(xì)胞遷移、侵襲和糖酵解。如預(yù)期，F(xiàn)OXO3A減少了乳腺癌細(xì)胞的遷移和侵襲(圖6C和6D)。敲除LINC00926大大削弱了FOXO3A抑制細(xì)胞遷移和侵襲的能力。FOXO3A過(guò)表達(dá)抑制葡萄糖攝取、乳酸生成和ATP生成，降低ECAR和增加OCR。然而，敲除LINC00926極大地減弱了FOXO3A調(diào)節(jié)細(xì)胞遷移、侵襲和糖酵解的能力(圖6C-6G)。綜上所述，F(xiàn)OXO3A抑制乳腺癌細(xì)胞的遷移和侵襲，以及糖酵解主要依賴于LINC00926。

7）FOXO3A/LINC00926/PGK1軸調(diào)節(jié)乳腺癌腫瘤生長(zhǎng)和肺轉(zhuǎn)移

為了證實(shí)FOXO3A/LINC00926/PGK1通路的體內(nèi)表型，我們首先通過(guò)將MDA-MB-231細(xì)胞注射到BALB/c小鼠的乳腺脂肪墊上，研究了LINC00926/PGK1軸對(duì)乳腺癌生長(zhǎng)的影響。與預(yù)期的一樣，下調(diào)LINC00926顯著增加了乳腺腫瘤的生長(zhǎng)。相反，當(dāng)PGK1被敲除時(shí)，腫瘤生長(zhǎng)被抑制。更重要的是，當(dāng)PGK1被敲除時(shí)，LINC00926敲除對(duì)腫瘤生長(zhǎng)的影響顯著減弱(圖7A-7C)。接下來(lái)，我們研究了FOXO3A/LINC00926軸對(duì)乳腺癌生長(zhǎng)的影響。結(jié)果顯示FOXO3A過(guò)表達(dá)顯著降低了乳腺癌的生長(zhǎng)。當(dāng)LINC00926敲低時(shí)，腫瘤生長(zhǎng)增加，F(xiàn)OXO3A過(guò)表達(dá)對(duì)腫瘤生長(zhǎng)的影響顯著減弱(圖7D-7F)。接下來(lái)，我們研究了該途徑對(duì)乳腺癌轉(zhuǎn)移的影響。與對(duì)照組相比，LINC00926基因抑制組在整個(gè)肺區(qū)域擴(kuò)散的結(jié)節(jié)數(shù)量明顯增加(圖7G)。相反，PGK1基因敲低導(dǎo)致乳腺癌細(xì)胞向肺轉(zhuǎn)移擴(kuò)散的減少。然而，PGK1下調(diào)極大地減弱了下調(diào)LINC00926調(diào)節(jié)肺轉(zhuǎn)移的能力(圖7G)。與腫瘤生長(zhǎng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致，下調(diào)LINC00926顯著減弱了FOXO3A調(diào)控肺轉(zhuǎn)移的能力(圖7H)。

8）人類乳腺癌患者中LINC00926和PGK1表達(dá)的相關(guān)性及LINC00926與葡萄糖攝取的相關(guān)性

我們通過(guò)IHC和FISH檢測(cè)109例人乳腺癌樣本中PGK1和LINC00926的表達(dá)情況。與培養(yǎng)細(xì)胞中LINC00926抑制PGK1的結(jié)果一致，LINC00926的表達(dá)與PGK1的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，與FOXO3A呈正相關(guān)(圖8A)。通過(guò)18FDG PET掃描評(píng)估葡萄糖攝取增加的乳腺腫瘤患者顯示LINC00926和FOXO3A表達(dá)降低，而PGK1表達(dá)增加(圖8B)。綜上所述，這些數(shù)據(jù)表明了LINC00926/PGK1軸在乳腺癌中的重要病理作用。

結(jié)論

我們的研究首次證實(shí)了LINC00926通過(guò)抑制糖酵解關(guān)鍵酶PGK1的表達(dá)來(lái)抑制糖酵解，從而在體內(nèi)外抑制乳腺癌細(xì)胞的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移。在乳腺癌患者中，F(xiàn)OXO3A調(diào)控的LINC00926與PGK1表達(dá)呈負(fù)相關(guān)。這些發(fā)現(xiàn)概述了FOXO3A/LINC00926/PGK1軸在Warburg效應(yīng)和乳腺腫瘤發(fā)生進(jìn)展中的重要性。因此，上調(diào)LINC00926可能是治療PGK1過(guò)表達(dá)的乳腺癌患者的一種有前途的方法。