巨噬細胞表型協(xié)調急性胰腺炎損傷后的炎癥和修復再生

急性胰腺炎 (AP) 是最常見的炎癥性胃腸道疾病之一，在小鼠和人類模型中似乎通過外分泌腺泡細胞的再生而恢復。巨噬細胞是由組織損傷引發(fā)的炎癥和組織再生反應的重要驅動因素，包括感染、自身免疫性疾病、機械或毒性損傷以及其他原因。在組織損傷時，骨髓 (BM) 衍生的巨噬細胞和/或組織駐留巨噬細胞被激活并以促炎方式響應局部環(huán)境，然后迅速轉變?yōu)閭谛迯捅硇?。巨噬細胞的表型和作用已在急性和慢性胰腺炎中得到充分證明。然而，關于巨噬細胞如何調節(jié)損傷后的胰腺修復/再生，包括 ADM 和腺泡再分化，我們知之甚少。

今天講一篇關于巨噬細胞表型變化與AP炎癥相關的文章，該文章題名為：Macrophage phenotypic switch orchestrates the inflammation and repair/regeneration following acute pancreatitis injury，IF=5.737，一區(qū)雜志。
AP損傷后胰腺巨噬細胞的表型變化

A動物模型使用雨蛙素誘導，。為了研究AP后的修復/再生過程，用更高劑量的雨蛙素（100μg/kg，每小時10次）誘導 AP，并在一周內的不同時間點收集胰腺。接受雨蛙素誘導治療的AP小鼠在24小時后顯示出腺泡壞死和白細胞浸潤的組織學跡象以及血清淀粉酶升高。第3天出現(xiàn)典型的腺泡-導管化生 (ADM) 結構，第7天左右迅速恢復正常腺泡。

為了檢測免疫細胞的比例，分離并分析了 AP 誘導后的胰腺白細胞。發(fā)炎的胰腺內最豐富的免疫細胞是巨噬細胞（CD11b⁺F4/80⁺CD11c^-）。流式細胞術分析的胰腺巨噬細胞數(shù)量在第1天和第3天顯著增加。根據(jù) F4/80 水平，胰腺巨噬細胞從第 1 天到第 3 天逐漸成熟。巨噬細胞在組織中的積累以兩種方式發(fā)生：單核細胞的募集和駐留巨噬細胞的增殖。AP 急性炎癥期的大多數(shù)巨噬細胞來自單核細胞的浸潤。根據(jù)我們的研究結果，與第 1 天相比，第 3 天的胰腺巨噬細胞具有更高的增殖能力。這可能部分解釋了第 3 天巨噬細胞的增加。此外，流式細胞術數(shù)據(jù)顯示 M2 樣巨噬細胞 (CD206 + IL4RA + )的百分比在第 1 天（急性炎癥期）下降并從第 3 天開始增加（ADM 階段），而這些 M2 樣巨噬細胞的數(shù)量在第 3 天達到峰值，然后迅速減少。此外，流式細胞術數(shù)據(jù)與免疫熒光分析一致，其中 F4/80 ⁺ CD206 ⁺細胞在第 3 天最豐富。

接下來，我們想知道這些 CCR2 +單核細胞/巨噬細胞是否可以在胰腺損傷后重新編程為 M2 樣巨噬細胞。在植入和誘導 AP 8 周后，我們發(fā)現(xiàn)第 3 天的增殖巨噬細胞 (Ki67 + ) 主要來自 CCR2 WT小鼠。與來自 CCR2 KO小鼠的巨噬細胞相比，來自 CCR2 WT小鼠的巨噬細胞表現(xiàn)出更高的 CD206 和 IL4RA 表達水平。綜上所述，結果表明，ADM 階段的 M2 樣巨噬細胞主要來源于 CCR2 +單核細胞/巨噬細胞，這些細胞在 AP 早期募集。

巨噬細胞在 AP 恢復不同階段的不同作用

鑒于 AP 恢復過程中巨噬細胞的表型變化，接下來試圖通過用脂質體清除巨噬細胞來檢查巨噬細胞在不同修復/再生階段的作用。首先，我們在急性炎癥反應后（從第 1 天到第 2 天）立即消耗了胰腺巨噬細胞，并在第 3 天檢查了胰腺。如圖所示，第 3 天之前巨噬細胞的消耗可以在很大程度上減少導管樣結構，這表明巨噬細胞在ADM的形成。AP 損傷后第 3天巨噬細胞的消耗顯著延遲了胰腺修復。Ki67 +細胞在第3天達到峰值，并隨著胰腺恢復逐漸下降。與組織學結果一致，發(fā)現(xiàn)CN處理組的Ki67 +細胞從第 5 天到第 7 天大幅下降，但在 CL 處理組中沒有，表明 CL 處理小鼠的修復過程受損。

此外，流式細胞儀分析證實，第 7 天胰腺中CD11b + F4/80 + CD206 +巨噬細胞顯著減少，這與免疫熒光數(shù)據(jù)一致。在總 CD11b +單核細胞/巨噬細胞中，成熟巨噬細胞 (F4/80 + MHCII hi ) 減少，而未成熟巨噬細胞 (F4/80 mid MHCII - ) 在第 7 天增加，此時胰腺巨噬細胞在 ADM 階段（第 3 天）短暫消耗。F4/80 mid MHCII -巨噬細胞表達更高水平的 CCR2 和 TNFα，表明它們與炎癥單核細胞（CD11b + Ly6C hi CCR2 +）分化并可能導致組織損傷。上述結果表明，ADM期胰腺巨噬細胞的耗竭（以M2樣表型為主），將觸發(fā)炎性單核細胞再次流入胰腺，從而在第7天造成組織損傷。

再生胰腺中胰腺巨噬細胞的動態(tài)轉錄組譜

為了進一步了解 AP 恢復過程中巨噬細胞的表型和功能，分離出胰腺巨噬細胞用于 RNA-seq 分析。顯著性差異表達基因繪制熱圖。為了評估這些基因簇的功能，使用網(wǎng)絡工具 DAVID Gene Ontology (GO) 進行了功能注釋分析。值得注意的是，在急性炎癥期（簇32，D1 特征簇）高度表達的基因特別富集炎癥反應和 CCR2 依賴性趨化性。簇 25 和 27 包含在 ADM 階段（第 3 天）高表達的基因，具有不同的表達模式和功能，表明該階段的巨噬細胞異質性。例如，與ECM-受體相互作用和PI3K-AKT信號通路相關的基因在簇27中富集，而與細胞周期相關的基因在簇25中富集。

巨噬細胞中 PI3K-AKT 激活促進 ADM 期后炎癥消退

基于 RNA-seq 數(shù)據(jù)，PI3K-AKT 信號在 ADM 期間在巨噬細胞中顯著富集。當觀察PI3K-AKT 通路中這些升高的基因時，發(fā)現(xiàn)80%的基因與細胞外基質 (ECM)-受體相互作用、生長因子/細胞因子-受體相互作用有關，表明它們參與了巨噬細胞與相鄰細胞之間的串擾。同時，在第 3 天在 CD11b + F4/80 + CD206 +胰腺巨噬細胞中觀察到更高的 AKT 激活。在ADM 階段抑制巨噬細胞的 PI3K-AKT 激活時，胰腺修復/再生明顯受到阻礙。通過流式細胞術分析，我們發(fā)現(xiàn)胰腺中 M2 樣巨噬細胞（CD11b + F4/80 + CD206 +）的數(shù)量變化較小，而未成熟巨噬細胞（CD11b + F4/80 mid）、炎性單核細胞（CD11b + Ly6C hi ) 和中性粒細胞 (CD11b + Ly6G + ) 顯著升高?？傊钄嘁认倬奘杉毎械?/span> PI3K-AKT 信號將觸發(fā)促炎反應和組織損傷，表明這些巨噬細胞在 ADM 階段（第 3 天）具有抗炎或促消退表型。

Il4ra缺陷小鼠的M2 樣巨噬細胞減少和再生失調

       為了探索再生過程中胰腺巨噬細胞的調節(jié)機制，我們進行了基因集富集分析 (GSEA) 以比較第 3 天和第 1 天巨噬細胞的轉錄組譜。巨噬細胞的 M2 激活和 IL4 刺激特征從第 3 天開始富含巨噬細胞。我們發(fā)現(xiàn)，表達IL-4和IL-13分別提高在第1天，和表達Il4ra自第1天升高，達到峰值在第3天。為了進一步確定受體和配體的細胞來源，在 AP 損傷后一天從胰腺中分離并比較了 CD45.2 +和 CD45.2 -細胞，有趣的是，Il4ra1被顯性免疫細胞上表達（CD45.2 +），而IL4和IL13中主要表達于實質細胞（CD45.2 - ）。此外，通過使用Il4ra 缺陷小鼠，我們證明了 IL4Rα 信號在 AP 損傷后胰腺修復/再生過程中介導了 M2 巨噬細胞的極化。值得注意的是，與它們的對應物相比，來自Il4ra -/-小鼠的胰腺在第 3 天和第 5 天具有更多的 ADM 結構?？偟膩碚f，這些發(fā)現(xiàn)表明 IL4/IL4Rα 軸是 AP 恢復過程中胰腺巨噬細胞 M2 極化所必需的，發(fā)揮抗炎功能來控制 ADM 形成的程度。

PGE2 增強 IL4Rα 信號以增強巨噬細胞的 M2 激活

巨噬細胞能夠響應可變的局部微環(huán)境信號從一種功能表型切換到另一種功能表型。除了經(jīng)典的信號級聯(lián)（例如，IL4/IL4Rα），巨噬細胞還可以整合由細胞外刺激觸發(fā)的代謝線索，以激活它們的 M2表型。在這里，我們想知道 PGE2 是否也參與了 AP 損傷后胰腺巨噬細胞的 M2 極化。為此，我們首先檢查了 AP 損傷后 PGE2 的動態(tài)表達。COX1 和 COX2 是產(chǎn)生前列腺素的兩種關鍵酶。在這里我們發(fā)現(xiàn)Ptgs2 (COX2)的表達在第 3 天達到峰值，而Ptgs1 (COX1)的表達在第 1 天下降并在第 3 天回到基礎水平。一致地，免疫熒光分析顯示 PGE2 在第 3 天升高，并在第 5 天迅速恢復到基礎水平。值得注意的是，PGE2在第 3 天主要與導管樣細胞（CK19 +細胞）共表達，以及部分與巨噬細胞（F4/80 +細胞）共表達。此外，根據(jù)我們的 RNA-seq 數(shù)據(jù)和流式細胞術分析，我們發(fā)現(xiàn)巨噬細胞中 COX2 的表達也在第 3 天達到峰值。更有趣的是，與 IL4Rα -巨噬細胞和單核細胞相比，IL4Rα +巨噬細胞表達了更高水平的 COX2。

為了研究 PGE2 是否有助于 M2 活化，來自野生型 (WT) 和Il4ra -/-小鼠的BM 衍生巨噬細胞 (BMDM)在體外與 PGE2 一起經(jīng)受 IL4/IL13。PGE2 單獨不影響 M2 激活，但大大增強了 IL4/IL13 觸發(fā)的 M2 激活。更有趣的是，IL4/IL13 促進了巨噬細胞中ptgs2 的表達，在 PGE2 的存在下可以進一步升高。PGE2 通過與稱為 E-前列腺素 (EP) 1-4 受體的 4 種不同 G 偶聯(lián)受體結合而發(fā)揮作用。不同受體的亞型決定了不同細胞類型的特定生理反應。通過使用特定的 EP 抑制劑，我們確定 PGE2 促進 M2 極化主要由 EP2 受體介導。此外，PGE2 可以促進 IL4Rα 表達，從而增強 IL4/IL4Rα 信號傳導。在 ADM 階段（第 2 天）之前抑制 PGE2 合成在很大程度上降低了 M2 激活并在第 3 天增加了胰腺中的 ADM 結構。總之，這些結果表明導管樣細胞和胰腺巨噬細胞在第 3 天釋放的 PGE2 增強了 M2 活化，并限制了再生胰腺中 ADM 的形成。