染色質(zhì)定向蛋白質(zhì)組學(xué)鑒定的前列腺癌細(xì)胞內(nèi)源性雄激素受體網(wǎng)絡(luò)

欄目:最新研究動態(tài) 發(fā)布時間:2021-06-28
雄激素和雄激素受體(AR)是激素激活轉(zhuǎn)錄因子(TF),是驅(qū)動前列腺癌(PCa)發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵因素。因此AR是晚期PCa激素治療的主要分子......


 

雄激素和雄激素受體(AR)是激素激活轉(zhuǎn)錄因子(TF),是驅(qū)動前列腺癌(PCa)發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵因素。因此AR是晚期PCa激素治療的主要分子靶點。雄激素剝奪療法,特別是第二代抗雄激素和雄激素合成抑制劑最初是有效的。然而,由于患者仍然可以從晚期PCa進(jìn)展到致命性去勢抗性前列腺癌(CRPC),需要新的治療靶點和生物標(biāo)志物。靶蛋白的一個來源可能是ar相關(guān)的染色質(zhì)蛋白。

大多數(shù)目前已知的核受體(NR)相互作用蛋白,包括那些AR,已經(jīng)通過遺傳篩選,如雙雜交系統(tǒng),免疫共沉淀和基于肽段的體外方法。盡管親和純化-質(zhì)譜耦合(MS)已經(jīng)啟發(fā)了NRs的輔助調(diào)節(jié)器,但它很少在代表NRs自然環(huán)境的條件下進(jìn)行。然而,通過利用RIME(內(nèi)源性蛋白快速免疫沉淀MS) Paltoglou等人和Stelloo等人已經(jīng)從PCa細(xì)胞交聯(lián)染色質(zhì)中鑒定了幾種內(nèi)源性AR相關(guān)蛋白。

核心調(diào)節(jié)因子通常作為蛋白質(zhì)復(fù)合物中的亞基存在,并以多種方式參與轉(zhuǎn)錄調(diào)控,例如通過調(diào)節(jié)組蛋白修飾和染色質(zhì)結(jié)構(gòu)。哺乳動物BRG1-brm相關(guān)的染色質(zhì)重塑復(fù)合物(BAF, SWI/SNF)改變了癌細(xì)胞染色質(zhì)可及性景觀。該復(fù)合物是細(xì)胞周期和增殖的關(guān)鍵調(diào)控因子,也是前列腺癌的驅(qū)動因子,具有多種癌癥特異性作用。此外,頻繁發(fā)生的TMPRSS2-ERG融合基因易位可使BAF復(fù)合物重新靶向于染色質(zhì),促進(jìn)前列腺癌的發(fā)生。互斥的ATPase亞基BRG1 (SMARCA4)BRM (SMARCA2)是復(fù)雜功能的關(guān)鍵組件。此外,ARDNA序列特異性轉(zhuǎn)錄因子(FOXA1、GATA2、ERGHOXB13)之間的合作已經(jīng)建立。TF FOXA1可以結(jié)合到封閉的染色質(zhì)區(qū)域,調(diào)節(jié)其染色質(zhì)可及性,從而促進(jìn)AR結(jié)合染色質(zhì)引發(fā)PCa。

20216月,在Oncogene雜志上發(fā)表了文章“Chromatin-directed proteomics-identified network of endogenous androgen receptor in prostate cancer cells..”。此報道通過運用了一種強(qiáng)大的染色質(zhì)導(dǎo)向蛋白質(zhì)組學(xué)方法,稱為ChIP-SICAP,揭示去勢抗性前列腺癌(CRPC)細(xì)胞中內(nèi)源性AR周圍染色質(zhì)蛋白網(wǎng)絡(luò)(染色質(zhì)蛋白網(wǎng)絡(luò))的組成。在CRPC細(xì)胞雄激素信號通路的背景下,進(jìn)一步研究了與AR相關(guān)蛋白作用的染色質(zhì)重塑者SMARCA4SIM2。通過整合ChIP-seq、RNA-seq、ATAC-seq和功能實驗的數(shù)據(jù),揭示SMARCA4AR在染色質(zhì)上廣泛共存,SMARCA4缺失影響了一組AR靶基因的染色質(zhì)可及性和表達(dá),也抑制了CRPC細(xì)胞的生長,驗證了SMARCA4CRPC細(xì)胞中的功能。雖然SIM2的沉默同樣降低了染色質(zhì)的可及性,但它影響了更多的雄激素調(diào)節(jié)基因的表達(dá)。在雞胚絨膜尿囊膜實驗中,SIM2沉默也降低了CRPC細(xì)胞的增殖和腫瘤的大小??傊?,此研究鑒定的AR染色體是研究這一重要藥物靶點的重要資源。
技術(shù)路線:

一、CRPC細(xì)胞中AR的染色體

散點圖顯示在VCaP細(xì)胞的兩個生物重復(fù)中由AR ChIP-SICAP鑒定的染色質(zhì)相關(guān)蛋白。在暴露于R1881(合成AR激動劑)中使用差異的silac標(biāo)記。在190ChIP-SICAP定量蛋白中,87個形成了r1881誘導(dǎo)的AR染色體,從而發(fā)現(xiàn)了可能與受體功能相互作用的蛋白。r1881誘導(dǎo)的AR chromatome被分為不同的功能蛋白組(1b)。DNArna結(jié)合蛋白,組蛋白,DNA修復(fù)和mRNA加工相關(guān)蛋白形成了大部分(~50%)的網(wǎng)絡(luò)。
二、SMARCA4共占據(jù)了大多數(shù)ar結(jié)合位點,但對其染色質(zhì)可及性的影響有限

SMARCA4AR共同占據(jù)的位點,以及雄激素如何影響共同占據(jù)。SMARCA4(61534)的大多數(shù)染色質(zhì)結(jié)合位點沒有受到DHT的影響(C1,圖2a),在C2位點,ARSMARCA4與結(jié)合高度相關(guān)。DHT增強(qiáng)了SMARCA4在這些位點的招募(集群C1,圖2b)。基序分析顯示,與C1位點相比,C2位點具有更高的雄激素響應(yīng)元件(AREs)富集,進(jìn)一步支持雄激素誘導(dǎo)的SMARCA4到染色質(zhì)上的募集。FOXA1、ERGHOXB13的基序依次在C1C2位點上同樣富集(2c)。ChIP-seq數(shù)據(jù)集顯示,FOXA1ERG的結(jié)合隨著激素暴露在C2位點而增加,而在C1位點則不增加(2de)。然而,HOXB13似乎在C1位點結(jié)合更多(2f)。與SMARCA4類似,SMARCC1[15](ChIP-SICAP中發(fā)現(xiàn))顯示與C1C2位點相結(jié)合(2g)。

重點分析了ARBs染色質(zhì)可及性的變化,發(fā)現(xiàn)雄激素通常增加了ARBs的可及性(3a, ATAC, siCTRL)。盡管SBsARBs之間有很大的重疊,但SMARCA4刪除僅減少了2149ARBs的染色質(zhì)可及性。這些sismarca4受影響的位點中有一半是開放的,不管激素暴露與否(pre-accessible),其余的在激素暴露后顯示其可及性增加(de novo位點,圖3ac)。被AR招募的SMARCA4增加染色質(zhì)可及性,潛在地協(xié)助其他因素招募到這些位點(3d,補(bǔ)充表2)。由于雄激素誘導(dǎo)了FOXA1sismarca4影響位點的結(jié)合(3e), AR誘導(dǎo)的SMARCA4的招募可能有助于雄激素誘導(dǎo)FOXA1的結(jié)合。上述結(jié)果表明SMARCA4CRPC細(xì)胞染色質(zhì)景觀的調(diào)節(jié)中既有AR依賴的作用,也有非ARr獨立的作用。
三、SMARCA4調(diào)節(jié)AR靶基因的表達(dá),參與細(xì)胞外基質(zhì)組織和細(xì)胞粘附

使用RNA-seq研究了SMARCA4缺失對有DHT和沒有DHTVCaP細(xì)胞基因表達(dá)的全基因組影響。后一組中,雄激素(A)下調(diào)的基因占大多數(shù)(~70%),而在前一組中,雄激素(A)下調(diào)和上調(diào)的基因數(shù)量增加大致相等(4a) 。與具有DHTsiCTRL相比,siSMARCA4931個差異表達(dá)基因(DEGs),其中363個基因雄激素顯著調(diào)控(4b, c)。對差異雄激素調(diào)節(jié)基因集進(jìn)行metasscape分析。耗盡SMARCA4可增加雄激素應(yīng)答基因的表達(dá),例如,分支結(jié)構(gòu)的形態(tài)發(fā)生和參與分化的細(xì)胞形態(tài)發(fā)生,而耗盡SMARCA4可抑制嘌呤代謝和細(xì)胞對藥物的反應(yīng)中富集的基因的表達(dá)(4d)。上述結(jié)果表明smarca4介導(dǎo)的染色質(zhì)可及性變化促進(jìn)了它們的表達(dá)。

使用測量細(xì)胞一致性的活細(xì)胞成像作為細(xì)胞生長和擴(kuò)散的代理,來測試SMARCA4消耗的影響是否轉(zhuǎn)化為VCaP細(xì)胞生長的改變。如圖5所示,在沒有雄激素的情況下,SMARCA4刪除并不影響細(xì)胞的生長,而在有雄激素的情況下,它降低了細(xì)胞的相對融合,盡管程度低于去除AR。SMARCA4刪除同樣會降低LNCaP細(xì)胞的相對融合。
四、SIM2沉默改變了arb亞群的染色質(zhì)可及性

 

SIM2沉默降低了2434arb染色質(zhì)可及性,三分之二受siSIM2影響的arb在雄激素暴露前可及(6a c中可獲得),而其余在雄激素暴露后可及(6a c中重新獲得)。根據(jù)ChIP-SICAP數(shù)據(jù),siim2受影響的位點中最富集的motifARE,盡管其在這些位點的富集程度低于未受siim2影響的位點(NC位點,圖6d)。AR、FOXA1、ERGHOXB13sisim2影響的位點的標(biāo)簽密度與NC位點相比均呈上升趨勢(6e),表明SIM2是一種與AR協(xié)同的TF。

SIM2是否也影響AR與染色質(zhì)的結(jié)合,我們在SIM2沉默后進(jìn)行AR ChIP-seq。如圖7所示,受體與大多數(shù)arb的結(jié)合沒有改變。然而,SIM2沉默影響2265 ARBs藥物通過降低和增加染色質(zhì)占用大約相同數(shù)量的地點(7 a、b)。當(dāng)反映這些siSIM2-affected染色質(zhì)易訪問性的變化,有趣的是,減少可訪問性是在690siSIM2-DN ARBs藥物(7 c、ef),而在siSIM2-UP arb中,染色質(zhì)可及性的變化不明顯(7c)。其余的(1744)siSIM2位點在AR結(jié)合方面沒有變化。大多數(shù)由SIM2沉默改變的arb并不與FOXA1缺失改變的arb重疊,這得到了基元分析的支持,表明FOXA1基元在siSIM2-DN arb上的富集少于在AR結(jié)合沒有變化的位點上的富集(7d)。
五、SIM2對ar介導(dǎo)的基因表達(dá)有顯著影響

利用RNAseq研究SIM2沉默后SIM2對基因表達(dá)的影響。沉默SIM2使dht調(diào)控的基因數(shù)量增加了一倍多,2394個基因受到雄激素調(diào)控,而只有180個基因受到雄激素調(diào)控(8a, b)。此外,沉默SIM2導(dǎo)致6867deg,其中2937deg受到雄激素調(diào)控(8c, d, Supplementary Fig. S19f)。SIM2沉默也減輕了雄激素對AR表達(dá)的抑制(補(bǔ)充圖S20)。根據(jù)RT-qPCR的評估,ARNT沉默實質(zhì)上再現(xiàn)了SIM2對選定AR靶基因和DEGs的影響(補(bǔ)充圖S21a, b)。對雄激素調(diào)節(jié)基因集的meta分析顯示,通過SIM2沉默,幾種途徑顯著富集。A_up/ siSIM2_up基因組和A_up/siSIM2_dn基因組中富集的最上面的通路分別是膜運輸和細(xì)胞對外界刺激的反應(yīng)(8e)。