高轉(zhuǎn)移肝細(xì)胞癌外泌體S100A4通過激活STAT3促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移

細(xì)胞間的相互作用在腫瘤進(jìn)展和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮關(guān)鍵作用。目前關(guān)于這些腫瘤細(xì)胞是如何與其他細(xì)胞相互交流的仍有很多是未知的。腫瘤釋放的外泌體被認(rèn)為是腫瘤進(jìn)行細(xì)胞間溝通的有效介質(zhì)。Dong等探索了肝細(xì)胞癌（HCC）外泌體在其轉(zhuǎn)移和預(yù)后價值中的功能。本文于2021年6月發(fā)表在《Signal Transduction and Targeted Therapy》期刊上，IF：13.493。 

技術(shù)路線：

主要實驗結(jié)果：

1、外泌體的分離與鑒定以及HCC細(xì)胞的釋放和吸收

使用投射電子顯微鏡觀察了外泌體的形態(tài)和形狀；納米粒子跟蹤分析發(fā)現(xiàn)外泌體直徑在40-200nm之間，并且在6個HCC細(xì)胞系外泌體中都檢測到了外泌體標(biāo)志物CD63，CD9，和Alix的表達(dá)；然后使用DIO標(biāo)記高轉(zhuǎn)移性HCC細(xì)胞的外泌體（HMH-exo）和低轉(zhuǎn)移性HCC細(xì)胞外泌體（LMH-exo），在激光掃描共焦顯微鏡下觀察到綠色標(biāo)記的HMH-exo和LMH-exo都可以被低轉(zhuǎn)移性HCC細(xì)胞細(xì)胞系有效吸收（圖1）。這些結(jié)果表明已經(jīng)成功分離和純化HCC來源的外泌體并且他們可以被其它HCC細(xì)胞吸收。

圖1外泌體的分離與鑒定以及HCC細(xì)胞的釋放和吸收

2、HMH-exo增強低轉(zhuǎn)移性HCC細(xì)胞系的轉(zhuǎn)移潛力

為了探究HCC轉(zhuǎn)移時外泌體在細(xì)胞與細(xì)胞串?dāng)_中的可能作用，作者實驗HMH-exo預(yù)處理低轉(zhuǎn)移性的HCC細(xì)胞系。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與LMH-exo或者PBS預(yù)處理組相比，HMH-exo顯著增強了低轉(zhuǎn)移性HCC細(xì)胞系的轉(zhuǎn)移能力；隨后作者使用低轉(zhuǎn)移性HCC細(xì)胞系構(gòu)建了體內(nèi)原位異種移植瘤模型，成瘤后使用外泌體治療6周，最后檢測肝臟腫瘤和肺轉(zhuǎn)移，結(jié)果顯示與其它組相比，HMH-exo組的肝臟腫瘤更大，肺轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)更多。（圖2）。這些結(jié)果表明HMH-exo可以在體內(nèi)外增強低轉(zhuǎn)移性HCC細(xì)胞的轉(zhuǎn)移能力。

圖2 HMH-exo增強低轉(zhuǎn)移性HCC細(xì)胞系的轉(zhuǎn)移潛力

3、外泌體S100A4是HCC細(xì)胞轉(zhuǎn)移潛力的關(guān)鍵增強子

為了探究通過HMH-exo增強HCC轉(zhuǎn)移能力的關(guān)鍵，作者對LMH-exo和HMH-exo進(jìn)行了iTRAQ質(zhì)譜篩選。結(jié)果從HMH-exo中鑒定到116個顯著上調(diào)和43顯著下調(diào)的蛋白質(zhì)；結(jié)果發(fā)現(xiàn)了4個蛋白家族的聚類：Apo、PSM、EEF/EIF和S100鈣結(jié)合蛋白家族（圖3a-b）。經(jīng)過文獻(xiàn)分析，作者主要關(guān)注了S100鈣結(jié)合蛋白家族，并以其中最顯著差異表達(dá)的4個蛋白為主：依次是S100A4，S100A6，S100A10，和 S100A11。作者檢測了這4個蛋白在5個HCC細(xì)胞系外泌體中的表達(dá)豐度，結(jié)果發(fā)現(xiàn)依然是S100A4的表達(dá)水平最高（圖3c）。因此，初步選擇S100A4進(jìn)行下一步分析。

進(jìn)一步檢測S100A4的功能，結(jié)果顯示敲除S100A4顯著降低高轉(zhuǎn)移性HCC細(xì)胞系的遷移和侵襲能力，過表達(dá)S100A4則顯著增強低轉(zhuǎn)移性HCC細(xì)胞系的遷移和侵襲能力（圖3d）。然后作者收集了S100A4敲除和S100A4過表達(dá)的HCC細(xì)胞的外泌體，結(jié)果得到了類似的結(jié)論，S100A4過表達(dá)外泌體顯著增強HCC細(xì)胞的遷移和侵襲，以及體內(nèi)肺部轉(zhuǎn)移的能力（圖3e-f）。這些結(jié)果證實了外泌體S100A4具有增強HCC細(xì)胞轉(zhuǎn)移潛力的功能。

圖3外泌體S100A4是HCC細(xì)胞轉(zhuǎn)移潛力的關(guān)鍵增強子 

4、外泌體S100A4通過STAT3磷酸化激活OPN轉(zhuǎn)錄

接下來探究了S100A4的作用機制，首先選擇了21個腫瘤干性相關(guān)基因，然后下載了GEO數(shù)據(jù)進(jìn)行相關(guān)性分析，結(jié)果顯示S100A4主要和11個基因正相關(guān)（圖4a）。隨后檢測了不同HCC細(xì)胞系中敲除和過表達(dá)S100A4后11個基因的表達(dá)水平的改變，結(jié)果顯示只有OPN是S100A4的下游基因，其表達(dá)受到S100A4的調(diào)控（圖4b-f）。OPN是促進(jìn)HCC轉(zhuǎn)移和干性的關(guān)鍵因子，但外泌體S100A4調(diào)節(jié)OPN的機制仍不清楚。

圖4 S100A4的表達(dá)與OPN正相關(guān)

有趣的是，研究報道S100A4可以增強STAT3的磷酸化，而STAT3的磷酸化與OPN的表達(dá)是相關(guān)的，并且STAT3被預(yù)測是OPN的潛在轉(zhuǎn)錄因子。因此，檢測了S100A4敲除和過表達(dá)后OPN表達(dá)，STAT3表達(dá)和STAT3磷酸化，結(jié)果顯示OPN表達(dá)和STAT3磷酸化水平與S100A4的變化趨勢一致；并且敲除STAT3后HCC細(xì)胞系中OPN表達(dá)和STAT3磷酸化被顯著抑制（圖5a-c）。這些結(jié)果表明S100A4可以激活STAT3磷酸化并增加OPN表達(dá)。

為了進(jìn)一步探究S100A4過表達(dá)外泌體對STAT3磷酸化和OPN表達(dá)的影響，使用該外泌體預(yù)處理HCC細(xì)胞，結(jié)果顯示它可以顯著促進(jìn) STAT3磷酸化和OPN表達(dá)，以及S100A4的表達(dá)（圖5d）。此外，在原位異種移植瘤模型中，HMH-exo顯著增強了核STAT3磷酸化和細(xì)胞質(zhì)OPN的表達(dá)（圖5e-f）。總之，以上結(jié)果表明S100A4過表達(dá)外泌體促進(jìn)低轉(zhuǎn)移性HCC細(xì)胞的轉(zhuǎn)移潛力，而外泌體S100A4是HCC細(xì)胞的關(guān)鍵增強子，其通過激活STAT3的磷酸化和上調(diào)OPN的表達(dá)實現(xiàn)其功能（圖6a）。

圖5 外泌體S100A4通過STAT3磷酸化激活OPN轉(zhuǎn)錄 

5、血漿外泌體S100A4和OPN水平聯(lián)合可以作為HCC患者術(shù)后的強力預(yù)后因子

在168例接受肝切除術(shù)的HCC患者中，進(jìn)一步研究了血漿外泌體S100A4和OPN水平的臨床意義。結(jié)果發(fā)現(xiàn)外泌體S100A4水平和OPN的表達(dá)顯著正相關(guān)，并且外泌體S100A4低表達(dá)組患者的總體生存率和無疾病生存率要顯著高于外泌體S100A4高表達(dá)組（圖6b-d）。隨后，基于外泌體S100A4水平和OPN水平的聯(lián)合分析，將患者分為4組，結(jié)果發(fā)現(xiàn)雙低水平S100A4和OPN組具有最好的預(yù)后，而雙高組則預(yù)后最差（圖6e-f）。

圖6血漿外泌體S100A4和OPN水平聯(lián)合可作為HCC患者術(shù)后的強力預(yù)后因子

參考文獻(xiàn)：

Sun Haoting., Wang Chaoqun., Hu Beiyuan., Gao Xiaomei., Zou Tiantian., Luo Qin., Chen Mo., Fu Yan., Sheng Yuanyuan., Zhang Kaili., Zheng Yan., Ren Xudong., Yan Shican., Geng Yan., Yang Luyu., Dong Qiongzhu., Qin Lunxiu.(2021). Exosomal S100A4 derived from highly metastatic hepatocellular carcinoma cells promotes metastasis by activating STAT3. Signal Transduct Target Ther, 6(1), 187. doi:10.1038/s41392-021-00579-3