腫瘤的自我促進(jìn)——外泌體miR-934誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞M2極化促進(jìn)CRC肝轉(zhuǎn)移

越來越多的證據(jù)表明腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞（TAMs）和外泌體在轉(zhuǎn)移前niche（生態(tài)位）形成中發(fā)揮重要作用。TAMs是轉(zhuǎn)移前生態(tài)位形成和結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移(CRLM)的基礎(chǔ)。然而，腫瘤來源的外泌體miRNAs與TAMs相互作用的分子機(jī)制仍然很大程度上未知。本研究發(fā)現(xiàn)腫瘤來源外泌體miR-934可以誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞M2極化，進(jìn)而促進(jìn)CRC的肝轉(zhuǎn)移。該文于2020年11月發(fā)表在《Journal of Hematology and Oncology》IF：11.059期刊上。

技術(shù)路線

主要實(shí)驗(yàn)結(jié)果

1、miR-934表達(dá)升高與CRLM進(jìn)展及預(yù)后不良呈正相關(guān)

為了揭示參與CRLM的miRNA，作者基于TCGA數(shù)據(jù)庫比較了CRC的1期腫瘤和4期腫瘤的miRNA表達(dá)譜，發(fā)現(xiàn)miR-934是在4期腫瘤中高表達(dá)差異表達(dá)最顯著的miRNA（Fig. 1a, b）。此外，作者將110個(gè)CRC組織按有無肝轉(zhuǎn)移分為兩組，發(fā)現(xiàn)肝轉(zhuǎn)移組與未轉(zhuǎn)移組相比，組織和血清miR-934表達(dá)上調(diào)（Fig. 1c, d）。接下來，為了研究miR-934在CRLM進(jìn)展中的作用，使用ISH比較了miR-934在包含308個(gè)CRC樣本的組織芯片(TMA)中的表達(dá)，與正常粘膜組織相比，CRC組織中miR-934的表達(dá)明顯上調(diào);miR-934表達(dá)增加與T分期、M分期、晚期AJCC分期和腫瘤復(fù)發(fā)呈正相關(guān)，尤其是在肝轉(zhuǎn)移的病例中（Fig. 1e）。以上數(shù)據(jù)提示，miR-934異常高表達(dá)與結(jié)直腸癌腫瘤進(jìn)展及肝轉(zhuǎn)移顯著相關(guān)。生存分析顯示，與miR-934表達(dá)較低的患者相比，miR-934表達(dá)較高的患者總生存期(OS)和無病生存期(DFS)較低（Fig. 1f, g）。因此，在CRLM患者中，miR-934高表達(dá)與CRLM進(jìn)展和預(yù)后不良呈正相關(guān)。

圖1 miR-934表達(dá)升高與CRLM進(jìn)展及預(yù)后不良呈正相關(guān)

2、miR-934存在于CRC細(xì)胞衍生的外泌體中

miR-934在HCT-8和LoVo的CM中的表達(dá)顯著高于其它細(xì)胞（Fig. 2a）。隨后，研究發(fā)現(xiàn)HCT-8和LoVo的CM中miR-934的表達(dá)顯著高于細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)（Fig. 2b, c）。并且，miR-934在CM中的表達(dá)不隨RNase A的處理而改變，而隨RNase A+Triton X-100的處理顯著下降（Fig. 2d），這表明細(xì)胞外的miR-934被膜包裹，而不是直接分泌。因此，推測(cè)miR-934可能是被外泌體傳輸。電鏡和納米顆粒追蹤分析表明，miR-934表達(dá)水平較高的CRC細(xì)胞分泌的外泌體比miR-934表達(dá)水平較低的CRC細(xì)胞分泌的外泌體更多（Fig. 2e, f）。各組外泌體標(biāo)志物CD9，ALIX，TSG101均被WB檢測(cè)到（Fig. 2g）。為了闡明miR-934是否主要來源于CRC細(xì)胞的外泌體，使用GW4869抑制CRC細(xì)胞的外泌體分泌，發(fā)現(xiàn)miR-934在CRC細(xì)胞來源的外泌體中的表達(dá)水平明顯高于外泌體耗盡的CRC細(xì)胞（Fig. 2h）。此外，采用qPCR分析miR-934在總CM、外泌體耗盡CM(超離心耗竭)和外泌體中的表達(dá)，結(jié)果顯示，miR-934在總CM或外泌體中的表達(dá)顯著高于外泌體缺失的CM（Fig. 2i）。此外，使用qPCR研究了上述四種CRC細(xì)胞系的外泌體中miR-934的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)外泌體中miR-934的表達(dá)模式與CRC細(xì)胞CM中的表達(dá)模式一致（Fig. 2j）。以上結(jié)果表明miR-934主要包裹在CRC細(xì)胞來源的外泌體中。

圖2 miR-934存在于CRC細(xì)胞衍生的外泌體中

3、CRC細(xì)胞來源的外泌體miR-934誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞M2極化

為了探索miR-934促進(jìn)CRLM的分子和細(xì)胞基礎(chǔ)，通過Cytoscape軟件注釋了TCGA cohort中191個(gè)miR-934相關(guān)基因的細(xì)胞功能，發(fā)現(xiàn)miR-934廣泛參與多種炎癥反應(yīng)，提示miR-934可能參與了CRC免疫微環(huán)境（Fig. 3a）。然后發(fā)現(xiàn)miR-934與巨噬細(xì)胞的基因信號(hào)特異性相關(guān)（Fig. 3b）。為了研究在CRLM中TAM的浸潤(rùn)與miR-934之間的相關(guān)性，我們?cè)谠l(fā)性結(jié)直腸癌組織和CRLM組織樣本中采用免疫組化染色檢測(cè)TAM標(biāo)記CD163。如圖3c所示，在CRLM組織中CD163+ TAM浸潤(rùn)豐富的區(qū)域觀察到miR-934表達(dá)升高。

將THP-1細(xì)胞與PMA孵育，誘導(dǎo)分化為M0巨噬細(xì)胞，M0巨噬細(xì)胞具有適當(dāng)?shù)馁N壁形態(tài)和巨噬細(xì)胞標(biāo)志物CD68的高表達(dá)（Fig. 3d）。接下來，研究了CRC細(xì)胞來源的外泌體對(duì)巨噬細(xì)胞M2極化的影響。如Fig. 3e所示，當(dāng)與巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)時(shí)，標(biāo)記有DiO(綠色)的CRC細(xì)胞來源的外泌體被未染色的巨噬細(xì)胞內(nèi)化。相比于低表達(dá)miR-934的細(xì)胞的外泌體孵育的巨噬細(xì)胞或PBS孵育的細(xì)胞，M2標(biāo)記物 (CD206, arginase-1, IL10和CD163)的表達(dá)在高表達(dá)miR-934的CRC細(xì)胞的外泌體孵育的巨噬細(xì)胞中顯著增加，而M1標(biāo)記物(iNOS和IL-1β)幾乎無差異（Fig. 3f, g）。

為了確定CRC細(xì)胞來源的外泌體miR-934是否誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞的M2極化，首先生成了miR-934 mimics和anti-miR-934來過表達(dá)或抑制miR-934的表達(dá)。與對(duì)照組相比，轉(zhuǎn)染miR-934 mimics的巨噬細(xì)胞M2標(biāo)記物(CD163、CD206、arginase-1和IL10)的表達(dá)明顯增加（Fig. 3h, i）。此外，用anti-miR-934、miR-934 mimics或其陰性對(duì)照載體轉(zhuǎn)染HCT-8和HT29細(xì)胞，提取其外泌體并添加到PMA處理的THP-1細(xì)胞中。結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染anti-miR-934或miR-934 mimics的CRC細(xì)胞的外泌體中M2標(biāo)記物(CD206、arginase-1、IL10和CD163)在PMA處理的THP-1細(xì)胞中表達(dá)明顯低于或高于載體對(duì)照組（Fig. 3j, k）。綜上所述，證實(shí)CRC細(xì)胞來源的外泌體miR-934可以誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞M2極化。

圖3 CRC細(xì)胞來源的外泌體miR-934誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞M2極化

4、hnRNPA2B1在外泌體miR-934向巨噬細(xì)胞轉(zhuǎn)移中發(fā)揮作用

據(jù)報(bào)道，外泌體RNA的分泌需要一種特定的RNA結(jié)合蛋白來轉(zhuǎn)運(yùn)。通過RNA pull-down分析和質(zhì)譜分析，鑒定了三種可能參與miR-934轉(zhuǎn)運(yùn)的RNA結(jié)合蛋白，并發(fā)現(xiàn)敲除hnRNPA2B1可以降低外泌體miR-934的表達(dá)（Fig. 4a, b）。hnRNPA2B1是一種RNA結(jié)合蛋白，通過與特定基序GGAG/CCCU結(jié)合，參與miRNAs的運(yùn)輸和轉(zhuǎn)錄后調(diào)控。特別是，由于miR-934序列中有兩個(gè)GGAG基序，我們推測(cè)hnRNPA2B1可能通過與GGAG序列結(jié)合，介導(dǎo)miR-934包裝成外泌體的過程。此外，miRNA pull-down分析顯示，在細(xì)胞質(zhì)和外泌體中，miR-934和hnRNPA2B1之間存在顯著的結(jié)合關(guān)系，然而，突變miR-934的結(jié)合序列(GGAG)可削弱這種結(jié)合（Fig. 4c）。RNA免疫沉淀分析進(jìn)一步證明，無論是在CRC細(xì)胞及其外泌體裂解物中，miR-934在anti-hnrnpa2b1抗體組中比在anti-IgG抗體組中更顯著富集（Fig. 4d）。此外，敲除hnRNPA2B1可以抑制外泌體miR-934從HCT8和LoVo細(xì)胞轉(zhuǎn)移到巨噬細(xì)胞的過程（Fig. 4e）。因此，這些結(jié)果證實(shí)hnRNPA2B1可以通過與miR-934的GGAG序列結(jié)合，介導(dǎo)miR-934包裝到CRC細(xì)胞外泌體中，并將外泌體miR-934轉(zhuǎn)移到巨噬細(xì)胞中。

圖4 hnRNPA2B1在外泌體miR-934向巨噬細(xì)胞轉(zhuǎn)移中發(fā)揮作用

5、外泌體miR-934通過下調(diào)PTEN表達(dá)和激活PI3K/AKT信號(hào)通路誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞M2極化

進(jìn)一步探索腫瘤來源的外泌體miR-934誘導(dǎo)M2巨噬細(xì)胞極化的機(jī)制。miR-934序列與PTEN的3 ' -UTR序列存在比對(duì)，提示miR-934可能靶向PTEN誘導(dǎo)M2巨噬細(xì)胞極化（Fig. 5a）。如Fig.5b所示，將miR-934 mimics或anti-miR-934及其控制載體轉(zhuǎn)染到PMA處理的THP-1細(xì)胞中，發(fā)現(xiàn)分別轉(zhuǎn)染miR-934 mimics或anti-miR-934和PTEN野生型結(jié)合位點(diǎn)組中PTEN的3’-UTR熒光素酶活性顯著降低或升高（Fig. 5b）。有趣的是，當(dāng)細(xì)胞與轉(zhuǎn)染了anti-miR-934、miR-934 mimics或其對(duì)照載體的HCT-8或HT29細(xì)胞的外泌體共培養(yǎng)時(shí)，熒光素酶活性模式顯示出與上述趨勢(shì)相同（Fig. 5c）。此外，PMA處理的THP-1細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-934 mimics或anti-miR-934，與各自的對(duì)照細(xì)胞相比，分別在mRNA和蛋白水平下調(diào)或上調(diào)了PTEN的表達(dá)（Fig. 5d）。類似的，分別用轉(zhuǎn)染anti-miR-934或miR-934 mimics的CRC細(xì)胞的外泌體孵育PMA處理的THP-1細(xì)胞，結(jié)果發(fā)現(xiàn)PTEN，PI3K/AKT的表達(dá)明顯高于或低于各自的對(duì)照組（Fig. 5e, f）。這些表明在PMA處理的THP-1細(xì)胞中，外泌體來源的miR-934可以通過靶向其3 ' -UTR和激活PI3K/AKT通路來下調(diào)PTEN的表達(dá)。

IL-3/IL-4能誘導(dǎo)M2巨噬細(xì)胞極化，預(yù)先用50ng /mL IL-3/IL-4處理THP-1細(xì)胞3天，驗(yàn)證anti-miR-934對(duì)M2巨噬細(xì)胞極化的影響。結(jié)果顯示PTEN過表達(dá)部分減弱了miR-934和HCT-8細(xì)胞來源外泌體對(duì)M2標(biāo)記物(CD206, arginase-1和IL10)表達(dá)的增強(qiáng)作用，而PTEN的沉默則相應(yīng)地逆轉(zhuǎn)了anti-miR-934對(duì)M2標(biāo)記物表達(dá)的衰減效應(yīng)（Fig. 5g, i）。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)M2巨噬細(xì)胞標(biāo)志物CD163在PMA處理的THP-1細(xì)胞中的表達(dá)，結(jié)果與上述結(jié)果一致（Fig. 5j）?？傊?，研究結(jié)果表明，miR-934增強(qiáng)了CRC細(xì)胞來源的外泌體對(duì)M2巨噬細(xì)胞極化誘導(dǎo)的增強(qiáng)作用，而anti-miR-934減弱了其增強(qiáng)作用。

PTEN是一種腫瘤抑制因子，調(diào)節(jié)多種細(xì)胞功能，包括細(xì)胞增殖和分化，PI3K/AKT信號(hào)通路是PTEN通過其磷酸酶活性靶向的最重要通路之一。因此，推測(cè)PI3K/AKT信號(hào)通路可能參與CRC細(xì)胞來源的外泌體miR-934誘導(dǎo)M2巨噬細(xì)胞極化。WB結(jié)果顯示過表達(dá)PTEN可以部分減弱miR-934和HCT-8細(xì)胞源外泌體對(duì)p-AKT和p-PI3K表達(dá)的增強(qiáng)作用，而沉默PTEN則相反（Fig. 5k）。更重要的是，當(dāng)與HCT-8細(xì)胞來源的外泌體和PI3K抑制劑(LY294002)共培養(yǎng)時(shí)，PMA處理的THP-1細(xì)胞中p-AKT和M2標(biāo)記物(CD206、arginase-1和CD163)的表達(dá)下調(diào)（Fig. 5l, m）。綜上所述，CRC細(xì)胞來源的外泌體miR-934可以通過下調(diào)PTEN表達(dá)和激活PI3K/AKT信號(hào)通路誘導(dǎo)M2巨噬細(xì)胞極化。

圖5外泌體miR-934通過下調(diào)PTEN表達(dá)和激活PI3K/AKT信號(hào)通路誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞M2極化

6、CRC細(xì)胞來源的外泌體miR-934誘導(dǎo)M2巨噬細(xì)胞極化促進(jìn)CRLM

將弱轉(zhuǎn)移的CRC細(xì)胞系SW480和RKO與miR-934 mimics預(yù)處理的THP-1細(xì)胞的CM共培養(yǎng)。結(jié)果顯示，無論是體內(nèi)還是體外，侵襲和轉(zhuǎn)移能力都隨著miR-934 mimics外泌體處理而升高，隨著anti-miR-934外泌體處理而下降（Fig. 6c–g）。這些結(jié)果表明，CRC細(xì)胞來源的外泌體miR-934誘導(dǎo)M2巨噬細(xì)胞極化可以增強(qiáng)CRC細(xì)胞的侵襲和肝轉(zhuǎn)移能力。

圖6 CRC細(xì)胞來源的外泌體miR-934誘導(dǎo)M2巨噬細(xì)胞極化促進(jìn)CRLM

7、CRC細(xì)胞來源的外泌體miR-934誘導(dǎo)M2巨噬細(xì)胞極化，通過激活CRC細(xì)胞中的CXCL13/CXCR5軸促進(jìn)CRLM

用HCT-8細(xì)胞來源的外泌體與陰性對(duì)照處理或PMA預(yù)處理的THP-1細(xì)胞孵育，分析趨化因子水平。如Fig.7a所示，CXCL13、IL-10和CCL22的表達(dá)水平遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于其他趨化因子的水平。然后，PMA-pretreated THP-1細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-934 mimics或NC，ELISA表明CXCL13的表達(dá)顯著增加(大約10倍)而CCL22和IL - 10(二至三倍)，這表明CXCL13可能在CRLM的進(jìn)展扮演了一個(gè)重要的角色（Fig. 7b）。此外，結(jié)果顯示，過表達(dá)miR-934或下調(diào)miR-934可部分增強(qiáng)或減弱HT29/HCT8細(xì)胞來源外泌體對(duì)M2巨噬細(xì)胞分泌CXCL13的增強(qiáng)作用（Fig. 7c）。

因?yàn)镃XCL13是一種趨化劑，可以促進(jìn)表達(dá)CXCR5的細(xì)胞趨化，使用IHC染色評(píng)估其在CRC中的表達(dá)，結(jié)果顯示CXCR-5在結(jié)直腸癌組織中的染色強(qiáng)于正常組織，說明M2極化巨噬細(xì)胞分泌的CXCL13主要作用于CRC細(xì)胞（Fig. 7d）。PMA預(yù)處理后的THP-1細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-934 mimics，并與加入anti-CXCL13抗體或IgG的SW480細(xì)胞或RKO細(xì)胞共培養(yǎng)。此外，上述TPH-1細(xì)胞液與敲除CXCR5的細(xì)胞共培養(yǎng)。體外transwell實(shí)驗(yàn)顯示，在與miR-934過表達(dá)PMA處理的THP-1細(xì)胞的CM共培養(yǎng)組中，anti-CXCL13抗體抑制了CRC細(xì)胞的遷移和侵襲；轉(zhuǎn)染了shCXCR5的SW480和RKO細(xì)胞與miR-934過表達(dá)PMA處理的THP-1細(xì)胞共培養(yǎng)時(shí)，遷移和侵襲能力降低（Fig. 7e, f）。此外，小鼠體內(nèi)肝轉(zhuǎn)移檢測(cè)表明，與對(duì)照組相比，用anti-CXCL13抗體或敲除CXCR5的CRC細(xì)胞的肝轉(zhuǎn)移菌落減少（Fig. 7g–i）。

圖7 CRC細(xì)胞來源的外泌體miR-934誘導(dǎo)M2巨噬細(xì)胞極化，通過激活CRC細(xì)胞中的CXCL13/CXCR5軸促進(jìn)CRLM

8、CXCL13/CXCR5/NFκB/p65/miR-934正反饋環(huán)路在CRLM期間介導(dǎo)M2巨噬細(xì)胞和CRC細(xì)胞之間的相互作用

如Fig. 8a所示，WB顯示，與對(duì)照組相比，SW480和RKO細(xì)胞中，CXCL13促進(jìn)p65磷酸化，NFκB、MMP2和MMP9的表達(dá)上調(diào)而IκBα的表達(dá)下調(diào)。CXCR5表達(dá)下調(diào)可部分減弱CXCL13的增強(qiáng)作用。此外，PMA處理的THP-1細(xì)胞用miR-934 mimics預(yù)處理，然后與SW480細(xì)胞或RKO細(xì)胞與anti-CXCL13抗體共培養(yǎng)，或與shCXCR5共培養(yǎng)。我們發(fā)現(xiàn)CRC細(xì)胞中的anti-CXCL13抗體或CXCR5敲低可以抑制miR-934過表達(dá)誘導(dǎo)的NFκB信號(hào)通路的活化（Fig. 8b）。值得注意的是，helenalin抑制NFκB/p65信號(hào)后，SW480和RKO細(xì)胞中miR-934、MMP2和MMP9的表達(dá)顯著低于對(duì)照組（Fig. 8c），這表明miR-934也可能通過正反饋回路被NFκB/p65信號(hào)正調(diào)控。

由于p65轉(zhuǎn)位到細(xì)胞核并促進(jìn)其靶向基因的轉(zhuǎn)錄，假設(shè)NFκB/p65信號(hào)通路的激活可通過p65的轉(zhuǎn)錄活性上調(diào)miR-934表達(dá)。在p65和miR-934啟動(dòng)子之間發(fā)現(xiàn)了5個(gè)潛在的轉(zhuǎn)錄結(jié)合區(qū)域和2個(gè)特異性結(jié)合位點(diǎn)（Fig. 8d）。隨后，用miR-934啟動(dòng)子中含有p65結(jié)合區(qū)域的載體轉(zhuǎn)染SW480和RKO細(xì)胞；ChIP實(shí)驗(yàn)證明p65對(duì)miR-934的轉(zhuǎn)錄在-2002和-1500 bp（區(qū)域1）之間的區(qū)域內(nèi)顯著增高，在其他四個(gè)結(jié)合區(qū)域中未觀察到明顯變化（Fig. 8e）。這些數(shù)據(jù)表明，區(qū)域1可能在調(diào)節(jié)CRC細(xì)胞中p65介導(dǎo)的miR-934轉(zhuǎn)錄誘導(dǎo)中起關(guān)鍵作用。熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)證實(shí)p65對(duì)SW480和RKO細(xì)胞中miR-934啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄影響（Fig. 8f）。作者發(fā)現(xiàn)只有突變結(jié)合位點(diǎn)1可以下調(diào)p65的熒光素酶報(bào)告基因活性，抑制miR-934的轉(zhuǎn)錄表達(dá)，這證明p65可以通過結(jié)合位點(diǎn)1正向直接調(diào)節(jié)miR-934的表達(dá)(Fig. 8f)。此外，作者證明了SW480和RKO細(xì)胞中的突變結(jié)合位點(diǎn)1可以消除CXCL13的促進(jìn)作用和NFκB/p65信號(hào)對(duì)miR-934表達(dá)的抑制作用(Fig. 8g,h)。綜上所述，這些結(jié)果證明CXCL13/CXCR5/NFκB/p65信號(hào)通路促進(jìn)CRC細(xì)胞中miR-934的轉(zhuǎn)錄，形成一個(gè)正反饋回路，參與持續(xù)的M2巨噬細(xì)胞極化和CRC細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。

圖8 CXCL13/CXCR5/NFκB/p65/miR-934正反饋環(huán)介導(dǎo)M2巨噬細(xì)胞與CRC細(xì)胞之間的相互作用CRLM

總之，如Fig. 9，CRC來源的外泌體miR-934可通過下調(diào)PTEN表達(dá)和激活PI3K/AKT信號(hào)通路誘導(dǎo)M2巨噬細(xì)胞極化。此外，外泌體miR-934極化的M2巨噬細(xì)胞可以通過CXCL13/CXCR5/NFκB/p65/miR934正反饋環(huán)促進(jìn)CRLM。因此，研究闡明了促進(jìn)腫瘤細(xì)胞和TAMs相互作用的CRLM的新分子機(jī)制，這將有助于開發(fā)CRLM的有效預(yù)防和治療策略。更重要的是，血清外泌體中miR-934高表達(dá)與CRLM相關(guān)，提示其可能是未來液體活檢和預(yù)測(cè)CRLM風(fēng)險(xiǎn)的一個(gè)有前景的生物標(biāo)志物。此外，靶向外泌體miR-934介導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞與TAMs之間的串?dāng)_可能為CRLM的治療提供新策略。

圖9 圖形摘要

參考文獻(xiàn)：

Zhao Senlin., Mi Yushuai., Guan Bingjie., Zheng Binbin., Wei Ping., Gu Yanzi., Zhang Zhengxiang., Cai Sanjun., Xu Ye., Li Xinxiang., He Xuefeng., Zhong Xinyang., Li Guichao., Chen Zhiyu., Li Dawei.(2020). Tumor-derived exosomal miR-934 induces macrophage M2 polarization to promote liver metastasis of colorectal cancer. J Hematol Oncol, 13(1), 156. doi:10.1186/s13045-020-00991-2