腫瘤的自我促進(jìn)——外泌體miR-934誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞M2極化促進(jìn)CRC肝轉(zhuǎn)移

越來(lái)越多的證據(jù)表明腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞（TAMs）和外泌體在轉(zhuǎn)移前niche（生態(tài)位）形成中發(fā)揮重要作用。TAMs是轉(zhuǎn)移前生態(tài)位形成和結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移(CRLM)的基礎(chǔ)。然而，腫瘤來(lái)源的外泌體miRNAs與TAMs相互作用的分子機(jī)制仍然很大程度上未知。本研究發(fā)現(xiàn)腫瘤來(lái)源外泌體miR-934可以誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞M2極化，進(jìn)而促進(jìn)CRC的肝轉(zhuǎn)移。該文于2020年11月發(fā)表在《Journal of Hematology and Oncology》IF：11.059期刊上。

技術(shù)路線

主要實(shí)驗(yàn)結(jié)果

1、miR-934表達(dá)升高與CRLM進(jìn)展及預(yù)后不良呈正相關(guān)

為了揭示參與CRLM的miRNA，作者基于TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)比較了CRC的1期腫瘤和4期腫瘤的miRNA表達(dá)譜，發(fā)現(xiàn)miR-934是在4期腫瘤中高表達(dá)差異表達(dá)最顯著的miRNA（Fig. 1a, b）。此外，作者將110個(gè)CRC組織按有無(wú)肝轉(zhuǎn)移分為兩組，發(fā)現(xiàn)肝轉(zhuǎn)移組與未轉(zhuǎn)移組相比，組織和血清miR-934表達(dá)上調(diào)（Fig. 1c, d）。接下來(lái)，為了研究miR-934在CRLM進(jìn)展中的作用，使用ISH比較了miR-934在包含308個(gè)CRC樣本的組織芯片(TMA)中的表達(dá)，與正常粘膜組織相比，CRC組織中miR-934的表達(dá)明顯上調(diào);miR-934表達(dá)增加與T分期、M分期、晚期AJCC分期和腫瘤復(fù)發(fā)呈正相關(guān)，尤其是在肝轉(zhuǎn)移的病例中（Fig. 1e）。以上數(shù)據(jù)提示，miR-934異常高表達(dá)與結(jié)直腸癌腫瘤進(jìn)展及肝轉(zhuǎn)移顯著相關(guān)。生存分析顯示，與miR-934表達(dá)較低的患者相比，miR-934表達(dá)較高的患者總生存期(OS)和無(wú)病生存期(DFS)較低（Fig. 1f, g）。因此，在CRLM患者中，miR-934高表達(dá)與CRLM進(jìn)展和預(yù)后不良呈正相關(guān)。

圖1 miR-934表達(dá)升高與CRLM進(jìn)展及預(yù)后不良呈正相關(guān)

2、miR-934存在于CRC細(xì)胞衍生的外泌體中

miR-934在HCT-8和LoVo的CM中的表達(dá)顯著高于其它細(xì)胞（Fig. 2a）。隨后，研究發(fā)現(xiàn)HCT-8和LoVo的CM中miR-934的表達(dá)顯著高于細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)（Fig. 2b, c）。并且，miR-934在CM中的表達(dá)不隨RNase A的處理而改變，而隨RNase A+Triton X-100的處理顯著下降（Fig. 2d），這表明細(xì)胞外的miR-934被膜包裹，而不是直接分泌。因此，推測(cè)miR-934可能是被外泌體傳輸。電鏡和納米顆粒追蹤分析表明，miR-934表達(dá)水平較高的CRC細(xì)胞分泌的外泌體比miR-934表達(dá)水平較低的CRC細(xì)胞分泌的外泌體更多（Fig. 2e, f）。各組外泌體標(biāo)志物CD9，ALIX，TSG101均被WB檢測(cè)到（Fig. 2g）。為了闡明miR-934是否主要來(lái)源于CRC細(xì)胞的外泌體，使用GW4869抑制CRC細(xì)胞的外泌體分泌，發(fā)現(xiàn)miR-934在CRC細(xì)胞來(lái)源的外泌體中的表達(dá)水平明顯高于外泌體耗盡的CRC細(xì)胞（Fig. 2h）。此外，采用qPCR分析miR-934在總CM、外泌體耗盡CM(超離心耗竭)和外泌體中的表達(dá)，結(jié)果顯示，miR-934在總CM或外泌體中的表達(dá)顯著高于外泌體缺失的CM（Fig. 2i）。此外，使用qPCR研究了上述四種CRC細(xì)胞系的外泌體中miR-934的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)外泌體中miR-934的表達(dá)模式與CRC細(xì)胞CM中的表達(dá)模式一致（Fig. 2j）。以上結(jié)果表明miR-934主要包裹在CRC細(xì)胞來(lái)源的外泌體中。

圖2 miR-934存在于CRC細(xì)胞衍生的外泌體中

3、CRC細(xì)胞來(lái)源的外泌體miR-934誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞M2極化

為了探索miR-934促進(jìn)CRLM的分子和細(xì)胞基礎(chǔ)，通過(guò)Cytoscape軟件注釋了TCGA cohort中191個(gè)miR-934相關(guān)基因的細(xì)胞功能，發(fā)現(xiàn)miR-934廣泛參與多種炎癥反應(yīng)，提示miR-934可能參與了CRC免疫微環(huán)境（Fig. 3a）。然后發(fā)現(xiàn)miR-934與巨噬細(xì)胞的基因信號(hào)特異性相關(guān)（Fig. 3b）。為了研究在CRLM中TAM的浸潤(rùn)與miR-934之間的相關(guān)性，我們?cè)谠l(fā)性結(jié)直腸癌組織和CRLM組織樣本中采用免疫組化染色檢測(cè)TAM標(biāo)記CD163。如圖3c所示，在CRLM組織中CD163+ TAM浸潤(rùn)豐富的區(qū)域觀察到miR-934表達(dá)升高。

將THP-1細(xì)胞與PMA孵育，誘導(dǎo)分化為M0巨噬細(xì)胞，M0巨噬細(xì)胞具有適當(dāng)?shù)馁N壁形態(tài)和巨噬細(xì)胞標(biāo)志物CD68的高表達(dá)（Fig. 3d）。接下來(lái)，研究了CRC細(xì)胞來(lái)源的外泌體對(duì)巨噬細(xì)胞M2極化的影響。如Fig. 3e所示，當(dāng)與巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)時(shí)，標(biāo)記有DiO(綠色)的CRC細(xì)胞來(lái)源的外泌體被未染色的巨噬細(xì)胞內(nèi)化。相比于低表達(dá)miR-934的細(xì)胞的外泌體孵育的巨噬細(xì)胞或PBS孵育的細(xì)胞，M2標(biāo)記物 (CD206, arginase-1, IL10和CD163)的表達(dá)在高表達(dá)miR-934的CRC細(xì)胞的外泌體孵育的巨噬細(xì)胞中顯著增加，而M1標(biāo)記物(iNOS和IL-1β)幾乎無(wú)差異（Fig. 3f, g）。

為了確定CRC細(xì)胞來(lái)源的外泌體miR-934是否誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞的M2極化，首先生成了miR-934 mimics和anti-miR-934來(lái)過(guò)表達(dá)或抑制miR-934的表達(dá)。與對(duì)照組相比，轉(zhuǎn)染miR-934 mimics的巨噬細(xì)胞M2標(biāo)記物(CD163、CD206、arginase-1和IL10)的表達(dá)明顯增加（Fig. 3h, i）。此外，用anti-miR-934、miR-934 mimics或其陰性對(duì)照載體轉(zhuǎn)染HCT-8和HT29細(xì)胞，提取其外泌體并添加到PMA處理的THP-1細(xì)胞中。結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染anti-miR-934或miR-934 mimics的CRC細(xì)胞的外泌體中M2標(biāo)記物(CD206、arginase-1、IL10和CD163)在PMA處理的THP-1細(xì)胞中表達(dá)明顯低于或高于載體對(duì)照組（Fig. 3j, k）。綜上所述，證實(shí)CRC細(xì)胞來(lái)源的外泌體miR-934可以誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞M2極化。

圖3 CRC細(xì)胞來(lái)源的外泌體miR-934誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞M2極化

4、hnRNPA2B1在外泌體miR-934向巨噬細(xì)胞轉(zhuǎn)移中發(fā)揮作用

據(jù)報(bào)道，外泌體RNA的分泌需要一種特定的RNA結(jié)合蛋白來(lái)轉(zhuǎn)運(yùn)。通過(guò)RNA pull-down分析和質(zhì)譜分析，鑒定了三種可能參與miR-934轉(zhuǎn)運(yùn)的RNA結(jié)合蛋白，并發(fā)現(xiàn)敲除hnRNPA2B1可以降低外泌體miR-934的表達(dá)（Fig. 4a, b）。hnRNPA2B1是一種RNA結(jié)合蛋白，通過(guò)與特定基序GGAG/CCCU結(jié)合，參與miRNAs的運(yùn)輸和轉(zhuǎn)錄后調(diào)控。特別是，由于miR-934序列中有兩個(gè)GGAG基序，我們推測(cè)hnRNPA2B1可能通過(guò)與GGAG序列結(jié)合，介導(dǎo)miR-934包裝成外泌體的過(guò)程。此外，miRNA pull-down分析顯示，在細(xì)胞質(zhì)和外泌體中，miR-934和hnRNPA2B1之間存在顯著的結(jié)合關(guān)系，然而，突變miR-934的結(jié)合序列(GGAG)可削弱這種結(jié)合（Fig. 4c）。RNA免疫沉淀分析進(jìn)一步證明，無(wú)論是在CRC細(xì)胞及其外泌體裂解物中，miR-934在anti-hnrnpa2b1抗體組中比在anti-IgG抗體組中更顯著富集（Fig. 4d）。此外，敲除hnRNPA2B1可以抑制外泌體miR-934從HCT8和LoVo細(xì)胞轉(zhuǎn)移到巨噬細(xì)胞的過(guò)程（Fig. 4e）。因此，這些結(jié)果證實(shí)hnRNPA2B1可以通過(guò)與miR-934的GGAG序列結(jié)合，介導(dǎo)miR-934包裝到CRC細(xì)胞外泌體中，并將外泌體miR-934轉(zhuǎn)移到巨噬細(xì)胞中。

圖4 hnRNPA2B1在外泌體miR-934向巨噬細(xì)胞轉(zhuǎn)移中發(fā)揮作用

5、外泌體miR-934通過(guò)下調(diào)PTEN表達(dá)和激活PI3K/AKT信號(hào)通路誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞M2極化

進(jìn)一步探索腫瘤來(lái)源的外泌體miR-934誘導(dǎo)M2巨噬細(xì)胞極化的機(jī)制。miR-934序列與PTEN的3 ' -UTR序列存在比對(duì)，提示miR-934可能靶向PTEN誘導(dǎo)M2巨噬細(xì)胞極化（Fig. 5a）。如Fig.5b所示，將miR-934 mimics或anti-miR-934及其控制載體轉(zhuǎn)染到PMA處理的THP-1細(xì)胞中，發(fā)現(xiàn)分別轉(zhuǎn)染miR-934 mimics或anti-miR-934和PTEN野生型結(jié)合位點(diǎn)組中PTEN的3’-UTR熒光素酶活性顯著降低或升高（Fig. 5b）。有趣的是，當(dāng)細(xì)胞與轉(zhuǎn)染了anti-miR-934、miR-934 mimics或其對(duì)照載體的HCT-8或HT29細(xì)胞的外泌體共培養(yǎng)時(shí)，熒光素酶活性模式顯示出與上述趨勢(shì)相同（Fig. 5c）。此外，PMA處理的THP-1細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-934 mimics或anti-miR-934，與各自的對(duì)照細(xì)胞相比，分別在mRNA和蛋白水平下調(diào)或上調(diào)了PTEN的表達(dá)（Fig. 5d）。類似的，分別用轉(zhuǎn)染anti-miR-934或miR-934 mimics的CRC細(xì)胞的外泌體孵育PMA處理的THP-1細(xì)胞，結(jié)果發(fā)現(xiàn)PTEN，PI3K/AKT的表達(dá)明顯高于或低于各自的對(duì)照組（Fig. 5e, f）。這些表明在PMA處理的THP-1細(xì)胞中，外泌體來(lái)源的miR-934可以通過(guò)靶向其3 ' -UTR和激活PI3K/AKT通路來(lái)下調(diào)PTEN的表達(dá)。

IL-3/IL-4能誘導(dǎo)M2巨噬細(xì)胞極化，預(yù)先用50ng /mL IL-3/IL-4處理THP-1細(xì)胞3天，驗(yàn)證anti-miR-934對(duì)M2巨噬細(xì)胞極化的影響。結(jié)果顯示PTEN過(guò)表達(dá)部分減弱了miR-934和HCT-8細(xì)胞來(lái)源外泌體對(duì)M2標(biāo)記物(CD206, arginase-1和IL10)表達(dá)的增強(qiáng)作用，而PTEN的沉默則相應(yīng)地逆轉(zhuǎn)了anti-miR-934對(duì)M2標(biāo)記物表達(dá)的衰減效應(yīng)（Fig. 5g, i）。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)M2巨噬細(xì)胞標(biāo)志物CD163在PMA處理的THP-1細(xì)胞中的表達(dá)，結(jié)果與上述結(jié)果一致（Fig. 5j）。總之，研究結(jié)果表明，miR-934增強(qiáng)了CRC細(xì)胞來(lái)源的外泌體對(duì)M2巨噬細(xì)胞極化誘導(dǎo)的增強(qiáng)作用，而anti-miR-934減弱了其增強(qiáng)作用。

PTEN是一種腫瘤抑制因子，調(diào)節(jié)多種細(xì)胞功能，包括細(xì)胞增殖和分化，PI3K/AKT信號(hào)通路是PTEN通過(guò)其磷酸酶活性靶向的最重要通路之一。因此，推測(cè)PI3K/AKT信號(hào)通路可能參與CRC細(xì)胞來(lái)源的外泌體miR-934誘導(dǎo)M2巨噬細(xì)胞極化。WB結(jié)果顯示過(guò)表達(dá)PTEN可以部分減弱miR-934和HCT-8細(xì)胞源外泌體對(duì)p-AKT和p-PI3K表達(dá)的增強(qiáng)作用，而沉默PTEN則相反（Fig. 5k）。更重要的是，當(dāng)與HCT-8細(xì)胞來(lái)源的外泌體和PI3K抑制劑(LY294002)共培養(yǎng)時(shí)，PMA處理的THP-1細(xì)胞中p-AKT和M2標(biāo)記物(CD206、arginase-1和CD163)的表達(dá)下調(diào)（Fig. 5l, m）。綜上所述，CRC細(xì)胞來(lái)源的外泌體miR-934可以通過(guò)下調(diào)PTEN表達(dá)和激活PI3K/AKT信號(hào)通路誘導(dǎo)M2巨噬細(xì)胞極化。

圖5外泌體miR-934通過(guò)下調(diào)PTEN表達(dá)和激活PI3K/AKT信號(hào)通路誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞M2極化

6、CRC細(xì)胞來(lái)源的外泌體miR-934誘導(dǎo)M2巨噬細(xì)胞極化促進(jìn)CRLM

將弱轉(zhuǎn)移的CRC細(xì)胞系SW480和RKO與miR-934 mimics預(yù)處理的THP-1細(xì)胞的CM共培養(yǎng)。結(jié)果顯示，無(wú)論是體內(nèi)還是體外，侵襲和轉(zhuǎn)移能力都隨著miR-934 mimics外泌體處理而升高，隨著anti-miR-934外泌體處理而下降（Fig. 6c–g）。這些結(jié)果表明，CRC細(xì)胞來(lái)源的外泌體miR-934誘導(dǎo)M2巨噬細(xì)胞極化可以增強(qiáng)CRC細(xì)胞的侵襲和肝轉(zhuǎn)移能力。

圖6 CRC細(xì)胞來(lái)源的外泌體miR-934誘導(dǎo)M2巨噬細(xì)胞極化促進(jìn)CRLM

7、CRC細(xì)胞來(lái)源的外泌體miR-934誘導(dǎo)M2巨噬細(xì)胞極化，通過(guò)激活CRC細(xì)胞中的CXCL13/CXCR5軸促進(jìn)CRLM

用HCT-8細(xì)胞來(lái)源的外泌體與陰性對(duì)照處理或PMA預(yù)處理的THP-1細(xì)胞孵育，分析趨化因子水平。如Fig.7a所示，CXCL13、IL-10和CCL22的表達(dá)水平遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于其他趨化因子的水平。然后，PMA-pretreated THP-1細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-934 mimics或NC，ELISA表明CXCL13的表達(dá)顯著增加(大約10倍)而CCL22和IL - 10(二至三倍)，這表明CXCL13可能在CRLM的進(jìn)展扮演了一個(gè)重要的角色（Fig. 7b）。此外，結(jié)果顯示，過(guò)表達(dá)miR-934或下調(diào)miR-934可部分增強(qiáng)或減弱HT29/HCT8細(xì)胞來(lái)源外泌體對(duì)M2巨噬細(xì)胞分泌CXCL13的增強(qiáng)作用（Fig. 7c）。

因?yàn)镃XCL13是一種趨化劑，可以促進(jìn)表達(dá)CXCR5的細(xì)胞趨化，使用IHC染色評(píng)估其在CRC中的表達(dá)，結(jié)果顯示CXCR-5在結(jié)直腸癌組織中的染色強(qiáng)于正常組織，說(shuō)明M2極化巨噬細(xì)胞分泌的CXCL13主要作用于CRC細(xì)胞（Fig. 7d）。PMA預(yù)處理后的THP-1細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-934 mimics，并與加入anti-CXCL13抗體或IgG的SW480細(xì)胞或RKO細(xì)胞共培養(yǎng)。此外，上述TPH-1細(xì)胞液與敲除CXCR5的細(xì)胞共培養(yǎng)。體外transwell實(shí)驗(yàn)顯示，在與miR-934過(guò)表達(dá)PMA處理的THP-1細(xì)胞的CM共培養(yǎng)組中，anti-CXCL13抗體抑制了CRC細(xì)胞的遷移和侵襲；轉(zhuǎn)染了shCXCR5的SW480和RKO細(xì)胞與miR-934過(guò)表達(dá)PMA處理的THP-1細(xì)胞共培養(yǎng)時(shí)，遷移和侵襲能力降低（Fig. 7e, f）。此外，小鼠體內(nèi)肝轉(zhuǎn)移檢測(cè)表明，與對(duì)照組相比，用anti-CXCL13抗體或敲除CXCR5的CRC細(xì)胞的肝轉(zhuǎn)移菌落減少（Fig. 7g–i）。

圖7 CRC細(xì)胞來(lái)源的外泌體miR-934誘導(dǎo)M2巨噬細(xì)胞極化，通過(guò)激活CRC細(xì)胞中的CXCL13/CXCR5軸促進(jìn)CRLM

8、CXCL13/CXCR5/NFκB/p65/miR-934正反饋環(huán)路在CRLM期間介導(dǎo)M2巨噬細(xì)胞和CRC細(xì)胞之間的相互作用

如Fig. 8a所示，WB顯示，與對(duì)照組相比，SW480和RKO細(xì)胞中，CXCL13促進(jìn)p65磷酸化，NFκB、MMP2和MMP9的表達(dá)上調(diào)而IκBα的表達(dá)下調(diào)。CXCR5表達(dá)下調(diào)可部分減弱CXCL13的增強(qiáng)作用。此外，PMA處理的THP-1細(xì)胞用miR-934 mimics預(yù)處理，然后與SW480細(xì)胞或RKO細(xì)胞與anti-CXCL13抗體共培養(yǎng)，或與shCXCR5共培養(yǎng)。我們發(fā)現(xiàn)CRC細(xì)胞中的anti-CXCL13抗體或CXCR5敲低可以抑制miR-934過(guò)表達(dá)誘導(dǎo)的NFκB信號(hào)通路的活化（Fig. 8b）。值得注意的是，helenalin抑制NFκB/p65信號(hào)后，SW480和RKO細(xì)胞中miR-934、MMP2和MMP9的表達(dá)顯著低于對(duì)照組（Fig. 8c），這表明miR-934也可能通過(guò)正反饋回路被NFκB/p65信號(hào)正調(diào)控。

由于p65轉(zhuǎn)位到細(xì)胞核并促進(jìn)其靶向基因的轉(zhuǎn)錄，假設(shè)NFκB/p65信號(hào)通路的激活可通過(guò)p65的轉(zhuǎn)錄活性上調(diào)miR-934表達(dá)。在p65和miR-934啟動(dòng)子之間發(fā)現(xiàn)了5個(gè)潛在的轉(zhuǎn)錄結(jié)合區(qū)域和2個(gè)特異性結(jié)合位點(diǎn)（Fig. 8d）。隨后，用miR-934啟動(dòng)子中含有p65結(jié)合區(qū)域的載體轉(zhuǎn)染SW480和RKO細(xì)胞；ChIP實(shí)驗(yàn)證明p65對(duì)miR-934的轉(zhuǎn)錄在-2002和-1500 bp（區(qū)域1）之間的區(qū)域內(nèi)顯著增高，在其他四個(gè)結(jié)合區(qū)域中未觀察到明顯變化（Fig. 8e）。這些數(shù)據(jù)表明，區(qū)域1可能在調(diào)節(jié)CRC細(xì)胞中p65介導(dǎo)的miR-934轉(zhuǎn)錄誘導(dǎo)中起關(guān)鍵作用。熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)證實(shí)p65對(duì)SW480和RKO細(xì)胞中miR-934啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄影響（Fig. 8f）。作者發(fā)現(xiàn)只有突變結(jié)合位點(diǎn)1可以下調(diào)p65的熒光素酶報(bào)告基因活性，抑制miR-934的轉(zhuǎn)錄表達(dá)，這證明p65可以通過(guò)結(jié)合位點(diǎn)1正向直接調(diào)節(jié)miR-934的表達(dá)(Fig. 8f)。此外，作者證明了SW480和RKO細(xì)胞中的突變結(jié)合位點(diǎn)1可以消除CXCL13的促進(jìn)作用和NFκB/p65信號(hào)對(duì)miR-934表達(dá)的抑制作用(Fig. 8g,h)。綜上所述，這些結(jié)果證明CXCL13/CXCR5/NFκB/p65信號(hào)通路促進(jìn)CRC細(xì)胞中miR-934的轉(zhuǎn)錄，形成一個(gè)正反饋回路，參與持續(xù)的M2巨噬細(xì)胞極化和CRC細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。

圖8 CXCL13/CXCR5/NFκB/p65/miR-934正反饋環(huán)介導(dǎo)M2巨噬細(xì)胞與CRC細(xì)胞之間的相互作用CRLM

總之，如Fig. 9，CRC來(lái)源的外泌體miR-934可通過(guò)下調(diào)PTEN表達(dá)和激活PI3K/AKT信號(hào)通路誘導(dǎo)M2巨噬細(xì)胞極化。此外，外泌體miR-934極化的M2巨噬細(xì)胞可以通過(guò)CXCL13/CXCR5/NFκB/p65/miR934正反饋環(huán)促進(jìn)CRLM。因此，研究闡明了促進(jìn)腫瘤細(xì)胞和TAMs相互作用的CRLM的新分子機(jī)制，這將有助于開(kāi)發(fā)CRLM的有效預(yù)防和治療策略。更重要的是，血清外泌體中miR-934高表達(dá)與CRLM相關(guān)，提示其可能是未來(lái)液體活檢和預(yù)測(cè)CRLM風(fēng)險(xiǎn)的一個(gè)有前景的生物標(biāo)志物。此外，靶向外泌體miR-934介導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞與TAMs之間的串?dāng)_可能為CRLM的治療提供新策略。

圖9 圖形摘要

參考文獻(xiàn)：

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