外泌體介導(dǎo)的CD44v6/C1QBP復(fù)合物與胰腺癌肝轉(zhuǎn)移

胰管腺癌(PDAC)有明顯的肝轉(zhuǎn)移傾向。促癌分泌體通過(guò)外泌體傳遞和運(yùn)輸是轉(zhuǎn)移前微環(huán)境形成和轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵。2021年4月發(fā)表于Gut（IF=19.819）的文章“Exosome-delivered CD44v6/C1QBP complex drives pancreatic cancer liver metastasis by promoting fibrotic liver microenvironment”對(duì)此進(jìn)行了探究。本研究旨在探討PDAC來(lái)源的外泌體(Pex)調(diào)控肝臟微環(huán)境、促進(jìn)轉(zhuǎn)移的潛在機(jī)制。Pex衍生的CD44v6/C1QBP復(fù)合物對(duì)于肝纖維化微環(huán)境和PDAC肝轉(zhuǎn)移的形成是必不可少的。高表達(dá)的外泌體CD44v6和C1QBP是預(yù)測(cè)PDAC患者預(yù)后和肝轉(zhuǎn)移的很有前途的生物標(biāo)志物。

技術(shù)路線

結(jié)果

1）Pex誘導(dǎo)肝纖維化微環(huán)境，促進(jìn)PDAC肝轉(zhuǎn)移

從小鼠正常胰腺(Npex)和小鼠PDAC細(xì)胞分離的外泌體呈現(xiàn)典型的外泌體結(jié)構(gòu)，大小約為50-150 nm(圖1A，B)。進(jìn)一步的western blot分析證實(shí)了分離的外泌體的存在(圖1C)。為了確定Pex在PDAC肝轉(zhuǎn)移中的作用，我們首先進(jìn)行了“教育”程序，并進(jìn)一步通過(guò)脾內(nèi)注射建立了PDAC肝轉(zhuǎn)移模型(圖1D)。在“教育”過(guò)程后，STE和原子力顯微鏡(AFM)顯示，與Npex組相比，Pex組小鼠的肝臟剛度顯著增加(圖1E，F)。此外，肝組織膠原密度增加(圖1G)，肝ECM明顯重構(gòu)(圖1H，I)。同樣，PDAC原位植入模型也顯示原位腫瘤可增加肝臟膠原沉積。肝轉(zhuǎn)移模型顯示，與Npex組相比，Pex組肝轉(zhuǎn)移更多，肝質(zhì)量更高(圖1J)。這些數(shù)據(jù)表明，Pex可以通過(guò)重構(gòu)肝臟ECM來(lái)誘導(dǎo)肝纖維化微環(huán)境，促進(jìn)PDAC肝轉(zhuǎn)移。

2）Pex增強(qiáng)肝衛(wèi)星細(xì)胞(HSCs)的活性

為了證實(shí)Pex的生物學(xué)功能，將原代小鼠肝細(xì)胞與Pex孵育，Pex被受體細(xì)胞吸收。然后使用免疫熒光染色對(duì)原發(fā)性肝細(xì)胞的類型進(jìn)行表征，結(jié)果顯示，desmin+HSCs和F4/80+Kupffer細(xì)胞吸收了Pex(圖2A)。我們接下來(lái)研究了Pex對(duì)HSCs生物學(xué)行為的影響，發(fā)現(xiàn)Pex顯著增強(qiáng)了HSCs的增殖和遷移能力(圖2B和C)。Pex與Npex處理的HSCs的凋亡沒(méi)有顯著差異(圖2D)。western blot和免疫熒光檢測(cè)結(jié)果顯示，Pex顯著上調(diào)α-SMA的表達(dá)，說(shuō)明Pex能促進(jìn)HSC的活化(圖2E和F)。我們觀察到Pex可以通過(guò)下調(diào)vitronectin和tenascin C的表達(dá)，上調(diào)collagen I和fibronectin的表達(dá)來(lái)調(diào)節(jié)HSCs中的ECM分泌(圖2G)。

3） IGF-1信號(hào)在Pex誘導(dǎo)的HSC活化和肝纖維化中至關(guān)重要

為了進(jìn)一步探索Pex調(diào)控HSC行為的機(jī)制，我們比較了Pex和Npex組間的HSC的RNA測(cè)序基因表達(dá)譜(圖3A)。在差異表達(dá)基因中，我們觀察到41個(gè)重疊的上調(diào)基因在Pan02 exo組與Npex組和KPC exo組與Npex組之間存在部分交集(圖3B)。主要涉及的基因參與細(xì)胞外空間、細(xì)胞外區(qū)域和ECM(圖3C)，表明Pex調(diào)節(jié)HSC的ECM分泌。此外，GO和KEGG通路分析顯示，IGF-1及其下游PI3K/AKT是受Pex影響的排名最高的信號(hào)通路(圖3D，E)。western blot分析支持了Pex顯著增加HSC中IGF- 1R、IRS-1和AKT磷酸化的發(fā)現(xiàn)(圖3F)。當(dāng)使用IGF-1R抑制劑時(shí)，Pex誘導(dǎo)的p-IGF-1R、p-IRS-1和p- AKT的上調(diào)被阻斷(圖3G)。基于這些結(jié)果，我們推測(cè)IGF-1信號(hào)可能是介導(dǎo)Pex依賴的HSC活化的關(guān)鍵因素。與預(yù)期的一樣，IGF-1R抑制劑抑制了Pex誘導(dǎo)的HSC的活化、增殖和遷移(圖4A-D)。此外，IGF-1R抑制劑逆轉(zhuǎn)了Pex誘導(dǎo)的HSC中ECM的產(chǎn)生(圖4E)。我們的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)表明，IGF-1R抑制劑可以阻斷Pex誘導(dǎo)的肝纖維化(圖4F-I)。這些數(shù)據(jù)表明IGF-1信號(hào)在Pex誘導(dǎo)的肝纖維化中起重要作用。

4）Pex來(lái)源的CD44v6對(duì)于HSCs的激活是必要的，但不是充分的

我們之前的研究揭示了CD44v6參與調(diào)控PDAC細(xì)胞的IGF-1通路。因此，我們首先驗(yàn)證了CD44v6在外泌體中的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)CD44v6在Pex中的表達(dá)水平明顯高于Npex(圖5A)。為了研究CD44v6是否能夠被傳遞到受體細(xì)胞中，我們采用蛋白合成抑制劑環(huán)己酰亞胺檢測(cè)加入Pex后CD44v6的蛋白水平。western blot分析顯示，加入Pex后，HSCs中CD44v6的表達(dá)水平明顯增加(圖5B)。與Npex-孵育的細(xì)胞相比，CD44v6的表達(dá)水平保持不變(圖5B)。我們還進(jìn)行了免疫熒光分析，檢測(cè)出HSC膜中CD44v6與Pan-cadherin共定位(圖5C)。這些結(jié)果表明，Pex可將CD44v6輸送到HSC膜。此外，western blot檢測(cè)表明，敲除CD44v6或使用抗CD44v6抗體的Pex強(qiáng)烈減弱了Pex誘導(dǎo)的IGF-1信號(hào)通路的激活(圖5D)。同時(shí)，在CD44v6- kd Pex或CD44v6抗體的作用下，Pex誘導(dǎo)的HSC活化(圖5E，F)、ECM重塑(圖5G)的積極作用顯著減少。為了闡明CD44v6在Pex誘導(dǎo)的HSC激活中的作用，我們進(jìn)一步研究了過(guò)表達(dá)CD44v6在HSC中是否與Pex具有同樣的激活HSC的作用。然而，過(guò)表達(dá)CD44v6并沒(méi)有像預(yù)期的那樣提高α-SMA的表達(dá)(圖5H)。這些結(jié)果表明，CD44v6在Pex誘導(dǎo)的HSC激活中發(fā)揮了重要作用。

5）Pex衍生的CD44v6/C1QBP復(fù)合物介導(dǎo)了Pex對(duì)肝纖維化和PDAC肝轉(zhuǎn)移的積極作用

此前，我們發(fā)現(xiàn)IGF-1可以通過(guò)誘導(dǎo)補(bǔ)體C1q結(jié)合蛋白(C1QBP)從細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)位到膜上，驅(qū)動(dòng)CD44v6/C1QBP復(fù)合物的形成，從而激活IGF-1下游通路。因此，我們很想知道C1QBP是否通過(guò)CD44v6相互作用參與Pex誘導(dǎo)的HSC活化。我們的結(jié)果表明C1QBP在Pex中的表達(dá)明顯高于Npex(圖6A)。如圖6B所示，C1QBP在Pex孵育的HSCs中表達(dá)高于Npex組。同時(shí)，與Pex處理的細(xì)胞相比，C1QBP-kd Pex處理HSCs后C1QBP蛋白水平顯著降低(圖6B)。與Pex轉(zhuǎn)移的CD44v6在HSCs中的位置一致，膜中也檢測(cè)到C1QBP，并與Pan-cadherin共定位(圖6C)。這些數(shù)據(jù)表明，C1QBP可以通過(guò)Pex傳遞到HSCs膜。免疫電鏡顯示CD44v6和C1QBP在Pex中共表達(dá)(圖6D)。同時(shí)過(guò)表達(dá)CD44v6和C1QBP后，Co- IP檢測(cè)顯示CD44v6和C1QBP在Pex中相互作用(圖6E)。此外，通過(guò)近距離連接(圖6F)和免疫熒光分析(圖6G)，我們發(fā)現(xiàn)了CD44v6和C1QBP在Pex孵化的HSCs膜上的結(jié)合。這些發(fā)現(xiàn)表明，CD44v6在傳遞外泌體CD44v6/C1QBP復(fù)合物中起重要作用。

與CD44v6敲低實(shí)驗(yàn)的結(jié)果相似，敲低Pex中的C1QBP在很大程度上抑制了α-SMA表達(dá)(圖6H)。過(guò)表達(dá)C1QBP并沒(méi)有上調(diào)α-SMA的表達(dá)(圖6I)。同時(shí)過(guò)表達(dá)CD44v6和C1QBP顯著增加了α-SMA的表達(dá)(圖6I)。與我們的體外研究一致，敲除Pex中的CD44v6或C1QBP逆轉(zhuǎn)了Pex誘導(dǎo)的HSC激活、肝臟剛度增加和肝臟ECM重塑的作用(圖6J-L)。脾內(nèi)注射肝轉(zhuǎn)移模型(圖6M)顯示，與Pex組相比，注射了CD44v6- kd或C1QBP- kd的Pex組小鼠的肝轉(zhuǎn)移減少。這些結(jié)果表明，Pex衍生的CD44v6/C1QBP復(fù)合物介導(dǎo)了Pex對(duì)肝纖維化和PDAC肝轉(zhuǎn)移的積極作用。

6）Pex衍生的CD44v6和C1QBP的高表達(dá)預(yù)示著PDAC患者的肝轉(zhuǎn)移和低生存率

采用免疫組化和western blot檢測(cè)肝轉(zhuǎn)移灶周圍肝組織和正常肝組織的纖維化ECM微環(huán)境。與體內(nèi)實(shí)驗(yàn)一致，纖維連接蛋白、I型膠原和α-SMA水平顯著升高，而玻連蛋白和固生蛋白C水平下調(diào)(圖7A，B)。接下來(lái)，我們研究了外泌體衍生CD44v6和C1QBP在PDAC患者中的預(yù)后價(jià)值。外泌體CD44v6和C1QBP在PDAC組織中的表達(dá)明顯高于正常胰腺組織(圖7C)。此外，有肝轉(zhuǎn)移的PDAC患者外泌體CD44v6和C1QBP的表達(dá)明顯高于無(wú)肝轉(zhuǎn)移的PDAC患者(圖7C)。免疫電鏡顯示，CD44v6和C1QBP在PDAC組織來(lái)源的EVs中共表達(dá)(圖7D)。Pex中CD44v6和C1QBP高表達(dá)的患者比其他患者更容易發(fā)生肝轉(zhuǎn)移 (圖7E)。此外，生存分析顯示，EV中CD44v6和C1QBP高表達(dá)的患者的生存結(jié)局明顯較差(圖7F)。循環(huán)外泌體的隨訪數(shù)據(jù)也顯示了一致的結(jié)果。PDAC患者中循環(huán)外泌體CD44v6和C1QBP的表達(dá)明顯高于健康對(duì)照組(圖7G)， PDAC伴有肝轉(zhuǎn)移的患者中循環(huán)外泌體CD44v6和C1QBP的表達(dá)明顯高于無(wú)肝轉(zhuǎn)移的患者(圖7G)。免疫電子顯微鏡顯示，CD44v6和C1QBP在PDAC患者的循環(huán)外泌體中共表達(dá)(圖7H)。高循環(huán)外泌體表達(dá)CD44v6和C1QBP的患者比其他患者更容易發(fā)生肝轉(zhuǎn)移 (圖7I)。然而，高表達(dá)循環(huán)外泌體CD44v6和C1QBP的患者生存率明顯較差(圖7J)?？傊?，我們的研究結(jié)果證實(shí)了CD44v6和C1QBP在組織源性EV和循環(huán)外泌體中的表達(dá)可以預(yù)測(cè)PDAC患者的預(yù)后和肝轉(zhuǎn)移。

結(jié)論：我們揭示了原代PDAC細(xì)胞和HSCs之間通過(guò)PDAC來(lái)源的外泌體進(jìn)行遠(yuǎn)距離的細(xì)胞通信。此外，Pex通過(guò)促進(jìn)肝纖維化微環(huán)境的形成來(lái)指示肝特異性轉(zhuǎn)移。更重要的是，我們發(fā)現(xiàn)外泌體CD44v6/C1QBP復(fù)合物傳遞到HSC的質(zhì)膜上誘導(dǎo)IGF-1信號(hào)通路的激活。外泌體CD44v6和C1QBP可能是預(yù)測(cè)PDAC患者預(yù)后的有前途的生物標(biāo)志物，也是治療PDAC肝轉(zhuǎn)移的潛在靶點(diǎn)。