在HER2陽(yáng)性乳腺癌中，PTEN和ATM軸控制G1/S細(xì)胞周期檢查點(diǎn)和腫瘤發(fā)生

PTEN包含一個(gè)n端磷酸酶結(jié)構(gòu)域，它可以使脂質(zhì)細(xì)胞膜的一種成分——磷脂酰肌醇3,4,5-三磷酸(PI(3,4,5)P3或PIP3)去磷酸化。PTEN通過(guò)去磷酸化PIP3的D3位，拮抗磷脂酰肌苷3-激酶(PI3K)通路。PI3K通路調(diào)節(jié)多種細(xì)胞過(guò)程，包括細(xì)胞代謝、存活、增殖、凋亡、生長(zhǎng)和遷移。這些基本的細(xì)胞過(guò)程，當(dāng)解除控制時(shí)，可以促進(jìn)或驅(qū)動(dòng)惡性表型。

PTEN功能突變的體細(xì)胞丟失在多種人類癌癥中被發(fā)現(xiàn)，包括乳腺癌、子宮內(nèi)膜癌、多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤、皮膚癌和前列腺癌。PTEN缺失是乳腺癌中常見(jiàn)的事件，與加速進(jìn)展和不良預(yù)后密切相關(guān)。特別是PTEN的表達(dá)已經(jīng)被提出在人表皮生長(zhǎng)因子受體2 (HER2)過(guò)表達(dá)乳腺癌中發(fā)揮重要作用。HER2是表皮生長(zhǎng)因子受體家族的一員，具有酪氨酸激酶活性。它的過(guò)表達(dá)，在大約15 - 20%的乳腺癌病例中觀察到，與侵襲性臨床行為和不良預(yù)后相關(guān)。曲妥珠單抗是一種與HER2胞外結(jié)構(gòu)域具有高親和力的單克隆抗體，是一種有效的治療HER2陽(yáng)性乳腺癌患者的方法。PTEN表達(dá)檢測(cè)的總有效率約為70%，而PTEN表達(dá)陰性患者的總有效率僅為20%。

PTEN功能的喪失通常與基因組的不穩(wěn)定性有關(guān)。此外，小鼠胚胎成纖維細(xì)胞(mef)中PTEN基因的缺失導(dǎo)致了未修復(fù)的DNA雙鏈斷裂的積累。PTEN缺失被認(rèn)為通過(guò)至少兩種分子機(jī)制促進(jìn)了基因組的完整性。在細(xì)胞核中，PTEN與著絲粒結(jié)合蛋白CENP-C結(jié)合，促進(jìn)著絲粒組裝和中期到后期的轉(zhuǎn)變。此外，作為轉(zhuǎn)錄因子E2F1的輔助因子，核PTEN似乎調(diào)節(jié)Rad51的表達(dá)，Rad51是DNA修復(fù)機(jī)制的關(guān)鍵組成部分。然而，后續(xù)的研究得出了不一致的結(jié)果，表明PTEN在轉(zhuǎn)錄水平上對(duì)RAD51的調(diào)控可能僅限于特定的細(xì)胞環(huán)境。

PTEN缺陷改變了多個(gè)細(xì)胞周期檢查點(diǎn)，可能留下更少的時(shí)間進(jìn)行DNA損傷修復(fù)和/或染色體分離。細(xì)胞周期的進(jìn)展需要幾個(gè)分子過(guò)程的完美執(zhí)行，以確保一個(gè)熟練的，無(wú)錯(cuò)誤的，細(xì)胞分裂。這些事件發(fā)生的速度由周期蛋白依賴激酶(CDKs)的活性決定，CDKs磷酸化關(guān)鍵底物以促進(jìn)DNA合成和有絲分裂進(jìn)程。CDKs的催化活性受細(xì)胞周期檢查點(diǎn)的調(diào)控，這些檢查點(diǎn)監(jiān)測(cè)細(xì)胞周期中主要事件的有序執(zhí)行。檢查點(diǎn)代表了故障安全機(jī)制，它確保只有在滿足的最佳情況下才允許細(xì)胞分裂。所有生物體都需要通過(guò)細(xì)胞分裂周期進(jìn)行適當(dāng)?shù)幕蚪M維護(hù)，以確保正常生殖、發(fā)育和預(yù)防包括癌癥在內(nèi)的各種疾病。DNA損傷可由內(nèi)源性過(guò)程引起，如DNA復(fù)制過(guò)程中偶爾引入的DNA不匹配，拓?fù)洚悩?gòu)酶I和拓?fù)洚悩?gòu)酶II活性失效導(dǎo)致的DNA鏈斷裂，或由正常代謝副產(chǎn)品產(chǎn)生的ROS攻擊DNA。外源性來(lái)源主要包括誘變化學(xué)品、紫外線和電離輻射(IR)。細(xì)胞周期檢查點(diǎn)能夠檢測(cè)DNA損傷，提示其存在，并激活延緩細(xì)胞周期進(jìn)程的通路，修復(fù)DNA損傷，或通過(guò)誘導(dǎo)細(xì)胞死亡來(lái)消除基因不穩(wěn)定細(xì)胞。

哺乳動(dòng)物細(xì)胞DNA損傷反應(yīng)(DDR)信號(hào)的核心是共濟(jì)失調(diào)毛細(xì)血管擴(kuò)張癥突變(ATM)和ATM-和rad3相關(guān)(ATR)蛋白激酶。ATM和ATR磷酸化并激活另外兩個(gè)激酶CHK1和CHK2, CHK1和CHK2與ATM和ATR一起，是細(xì)胞周期檢查點(diǎn)[24]的主調(diào)節(jié)器。通過(guò)調(diào)節(jié)CDKs的活性，這些分子在細(xì)胞周期G1 S期、S內(nèi)期和G2 M期減緩或阻止細(xì)胞周期進(jìn)程，使DNA損傷得以修復(fù)。ATM和ATR通過(guò)控制不同因子在DNA損傷位點(diǎn)的表達(dá)、活性或招募來(lái)促進(jìn)DNA修復(fù)。一般來(lái)說(shuō)，DDR機(jī)制能夠修復(fù)細(xì)胞在其生命周期中積累的DNA損傷，但如果認(rèn)為損傷程度過(guò)高，就會(huì)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡或細(xì)胞衰老導(dǎo)致細(xì)胞死亡。

2021年4月，加拿大University Ave和中國(guó)香港大學(xué)團(tuán)隊(duì)與癌癥研究所表觀遺傳學(xué)和基因組穩(wěn)定性小組在Cell Death & Differentiation 雜志上發(fā)表了文章“The PTEN and ATM axis controls the G1/S cell cycle checkpoint  and tumorigenesis in HER2-positive breast cancer”。此報(bào)道發(fā)現(xiàn)ATM磷酸化PTEN的398位(人類蘇氨酸;在小鼠絲氨酸)的激活，為了理解ATM磷酸化PTEN的生物學(xué)意義，建立了一個(gè)小鼠模型，構(gòu)建了一個(gè)不能被ATM磷酸化的PTEN突變形式，用398位(PTEN- 398a)的絲氨酸取代了丙氨酸。PTEN-398A的表達(dá)可加速her2陽(yáng)性乳腺癌小鼠模型的腫瘤發(fā)展和進(jìn)展。利用分子生物學(xué)方法，發(fā)現(xiàn)了一種新的機(jī)制，通過(guò)ATM磷酸化PTEN調(diào)節(jié)其細(xì)胞再分配，并有助于該蛋白的腫瘤抑制功能。

技術(shù)路線：

一、Pten398A加速MMTVneu驅(qū)動(dòng)的乳腺腫瘤發(fā)生

為了研究ATM磷酸化PTEN的體內(nèi)功能，我們?cè)谛∈笾性O(shè)計(jì)了一個(gè)敲入等位基因，其中398位絲氨酸取代了丙氨酸(Pten398A)。Pten398A/+和Pten398A/398A小鼠存活，發(fā)育明顯正常。為了研究atm依賴的PTEN磷酸化在乳腺癌中的可能作用，我們?cè)谛∈笕橄倌[瘤病毒(MMTV)啟動(dòng)子/增強(qiáng)子轉(zhuǎn)錄控制下表達(dá)滅活neu (Erbb2)融合基因的小鼠背景下培養(yǎng)了Pten398A等位基因。在這個(gè)成熟的模型中，MMTVneu基因在正常乳腺上皮中低水平表達(dá)，導(dǎo)致乳腺腫瘤的發(fā)展，據(jù)報(bào)道中位發(fā)生率為205天。Pten+/+;MMTVneu小鼠發(fā)生了預(yù)期潛伏期的乳腺腫瘤，顯示了233天的中位生存期(圖1A)。相比之下，Pten398A/398A;MMTVneu小鼠腫瘤發(fā)展加快，中位生存期縮短至199天(圖1A)。對(duì)Pten+/+;MMTVneu和Pten398A/398A;MMTVneu小鼠的石蠟包埋腫瘤標(biāo)本進(jìn)行免疫組化檢測(cè)γH2AX。采用半定量方法對(duì)γH2AX免疫反應(yīng)性進(jìn)行評(píng)分(表1)。Pten+/+;MMTVneu腫瘤一般很少表達(dá)γH2AX(圖1B)。所有Pten398A/398A;MMTVneu樣本均為γH2AX強(qiáng)陽(yáng)性，表明更高水平的基因組不穩(wěn)定性(圖1B, C)。我們通過(guò)對(duì)腫瘤樣本的western blot分析證實(shí)了這些結(jié)果，結(jié)果顯示Pten398A/398A;MMTVneu腫瘤比Pten+/+;MMTVneu腫瘤表達(dá)更高水平的γH2AX(圖1D, E)。通過(guò)對(duì)Ki-67進(jìn)行免疫組化來(lái)評(píng)估腫瘤的增殖指數(shù)，Ki-67是常規(guī)病理中廣泛使用的標(biāo)志物。兩種基因型Pten+/+腫瘤的Ki67免疫反應(yīng)性無(wú)顯著差異;MMTVneu(補(bǔ)充圖2C, D)?？傊?，Pten398A突變加速mmtv神經(jīng)驅(qū)動(dòng)的腫瘤發(fā)生，這與更高的基因組不穩(wěn)定性有關(guān)，但在細(xì)胞增殖中沒(méi)有明顯的改變。

二、阻斷atm依賴的PTEN磷酸化導(dǎo)致基因組

為了確定ATM介導(dǎo)的PTEN磷酸化如何調(diào)節(jié)DDR，構(gòu)建Pten398A/398A和Pten+/+ littermates MEFs細(xì)胞模型。PTEN蛋白水平不受398A突變的影響(補(bǔ)充圖3A, B)。此外，磷酸化AKT (PI3K通路活性的標(biāo)記物)水平在Pten398A/398A和PTEN +/+ MEFs中相似(補(bǔ)充圖3B)。構(gòu)建人乳腺上皮細(xì)胞系(MCF10A)，穩(wěn)定表達(dá)野生型PTEN (PTEN- wt)，或PTEN的突變形式，不能被ATM磷酸化(PTEN- 398a)。在這些細(xì)胞中，內(nèi)源性的PTEN基因被CRISPR/Cas9編輯刪除，創(chuàng)建了PTEN空細(xì)胞，然后用野生型或突變型的蛋白質(zhì)穩(wěn)定轉(zhuǎn)導(dǎo)重組。在表達(dá)PTEN- wt和PTEN- 398a的MCF10A細(xì)胞中，PTEN蛋白和磷酸化AKT水平相似(補(bǔ)充圖3A)，使這些細(xì)胞成為ATM磷酸化PTEN分子作用研究的合適替代模型。

Pten+/+和Pten398A/398A mef在10gy IR作用下，通過(guò)測(cè)定每個(gè)細(xì)胞的γH2AX和53bp1病灶數(shù)量來(lái)評(píng)估其修復(fù)DNA損傷的能力。在Pten+/+ mef中，我們觀察到在照射后4小時(shí)，每個(gè)細(xì)胞的病灶數(shù)量達(dá)到峰值，24小時(shí)后恢復(fù)到接近基線水平(圖2A C)。Pten+/+和Pten398A/398A在ir后4小時(shí)，每個(gè)細(xì)胞聚集的病灶數(shù)量相似。然而，Pten398A/398A mef在24小時(shí)時(shí)間點(diǎn)比Pten+/+ mef保留了更多的病灶數(shù)，表明DNA修復(fù)能力降低(圖2 C)。

三、pten - s38a突變誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡抵抗

為了進(jìn)一步了解阻斷atm依賴的PTEN磷酸化如何影響細(xì)胞對(duì)基因毒性損傷的反應(yīng)，我們使用抗體陣列評(píng)估了表達(dá)PTEN- wt或PTEN- 398a的MCF10A細(xì)胞裂解液的應(yīng)激反應(yīng)和凋亡通路的活性。

Pten+/+和Pten398A/398A MEF培養(yǎng)，表達(dá)Pten - wt的MCF10A細(xì)胞與表達(dá)Pten -398A的MCF10A細(xì)胞在正常培養(yǎng)條件下的生長(zhǎng)速率均無(wú)差異(圖3A和補(bǔ)充圖5C)。對(duì)細(xì)胞進(jìn)行不同的基因毒性脅迫處理:IR、順鉑和柔紅霉素。在所有條件下，Pten398A/398A MEFs和PTEN-398A表達(dá)的MCF10A細(xì)胞對(duì)基因毒性脅迫的抗性均高于野生型PTEN的細(xì)胞(圖3B D和Supplementary Fig. 5D, E)。通過(guò)流式細(xì)胞儀Annexin V染色判斷(圖3E)。通過(guò)使用caspase-3抗體對(duì)Pten+/+、MMTVneu和Pten398A/398A、MMTVneu腫瘤進(jìn)行免疫組化染色，證實(shí)了這些觀察結(jié)果。caspase-3抗體是一種廣泛用于檢測(cè)凋亡細(xì)胞的標(biāo)志物。確實(shí)，MMTVneu腫瘤的caspase-3陽(yáng)性細(xì)胞比相應(yīng)的Pten+/+少;綜上所述，這些結(jié)果表明，PTEN不能被ATM磷酸化的細(xì)胞對(duì)基因毒性應(yīng)激誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡具有抗性。為了評(píng)估表達(dá)PTEN-398A且DNA損傷未解決的細(xì)胞在輻照(圖2B, C和補(bǔ)充圖4B, C)后的持續(xù)存在是否是誘導(dǎo)凋亡反應(yīng)失敗的結(jié)果，我們?cè)?span>IR之前先用泛caspase抑制劑z-VAD-FMK (zVAD)對(duì)細(xì)胞進(jìn)行預(yù)處理。與DMSO處理相比，zVAD增加了PTEN-WT細(xì)胞中未解決的DNA損傷灶的數(shù)量，其水平與DMSO處理的PTEN-398A細(xì)胞相當(dāng)(補(bǔ)充圖5F)。然而，需要注意的是，zVAD預(yù)處理也略微增加了IR后PTEN-398A細(xì)胞中未解決的DNA損傷灶的數(shù)量。

四、atm依賴性PTEN磷酸化缺失的細(xì)胞中G1/S細(xì)胞周期檢查點(diǎn)受損

對(duì)表達(dá)PTEN-WT或PTEN-398A的MCF10A細(xì)胞進(jìn)行了cDNA微陣列分析，并用順鉑誘導(dǎo)基因毒性應(yīng)激。差異表達(dá)基因列表采用基因集合富集分析[39]進(jìn)行分析。有趣的是，表達(dá)PTEN- 398A的細(xì)胞中上調(diào)的基因與G1/S檢查點(diǎn)的激活有關(guān)，如G1/S期特異性轉(zhuǎn)錄、E2F靶標(biāo)、Rb1通路控制的細(xì)胞周期調(diào)控基因等

推測(cè)表達(dá)PTEN-398A的細(xì)胞對(duì)基因毒性脅迫的抗性可能是由于未能阻止細(xì)胞周期以應(yīng)對(duì)DNA損傷。為了測(cè)試這種可能性，測(cè)量了表達(dá)野生型或突變PTEN的同步細(xì)胞在細(xì)胞周期阻滯在G1/ S檢查點(diǎn)的能力，以應(yīng)對(duì)DNA損傷。在表達(dá)PTEN-WT或PTEN-398A的正常周期細(xì)胞中，G1、S、G2/M期細(xì)胞比例沒(méi)有明顯差異(圖4A)。為了使細(xì)胞在G1/S檢查點(diǎn)同步，我們對(duì)它們施加雙胸腺嘧啶脈沖。這種處理有效地抑制了PTEN-WT和PTEN-398A細(xì)胞在G1/S邊界(圖4B)。然后在正常生長(zhǎng)培養(yǎng)基中釋放細(xì)胞，在S期進(jìn)展期間用IR處理，6小時(shí)后收集細(xì)胞，用流式細(xì)胞術(shù)分析細(xì)胞周期分布(實(shí)驗(yàn)方案見(jiàn)補(bǔ)充圖7A)。大部分PTEN-WT細(xì)胞被阻滯在s期，而PTEN-398A細(xì)胞未能阻滯細(xì)胞周期，而是發(fā)展到G2/M期(圖4C)。通過(guò)測(cè)定表達(dá)磷酸化組蛋白H3 (Ser10)的細(xì)胞比例，證實(shí)了這一觀察結(jié)果。磷酸化組蛋白H3 (Ser10)標(biāo)志著細(xì)胞處于有絲分裂階段。(圖4 d)。

表達(dá)PTENWT的細(xì)胞，在雙胸苷激酶阻斷和輻射釋放后被阻滯在S期，表現(xiàn)出低水平的CDK2磷酸化(圖5A)。相反，經(jīng)過(guò)相同處理的PTEN-398A細(xì)胞有更高水平的磷酸化CDK2(圖5A)，這與DNA損傷檢查點(diǎn)的缺陷激活一致。與PTEN-WT細(xì)胞相比，PTEN-398細(xì)胞中磷酸化的AKT和磷酸化的p27Kip1水平更高(圖5B)。雖然p27Kip1與CDK2和Cyclin E在照射過(guò)的PTEN-WT細(xì)胞中有效地共免疫沉淀，但在PTEN-398A細(xì)胞中這些相互作用減弱(圖5C, D)。與我們?cè)?span>MCF10A細(xì)胞中觀察到的結(jié)果一致，免疫印跡分析顯示PTEN398A/398A裂解物中磷酸化的AKT和磷酸化的p27Kip1水平更高;MMTVNeu腫瘤與Pten+/+;MMTVNeu對(duì)應(yīng)腫瘤進(jìn)行比較(圖5E-H)。

總之，抑制ATM對(duì)PTEN的磷酸化增加了DNA損傷后AKT和p27Kip1的激活，反過(guò)來(lái)有利于CDK2/Cyclin E復(fù)合物的活性，并驅(qū)動(dòng)細(xì)胞周期進(jìn)程。

五、阻斷atm依賴的磷酸化會(huì)損害DNA損傷后PTEN的亞細(xì)胞再分配

研究了磷脂酰肌醇3,4,5磷酸(PIP3)在DNA損傷后的細(xì)胞定位。將MCF10A細(xì)胞按上述方法同步輻照，免疫熒光法分析PTEN的亞細(xì)胞分布。PTEN-WT和PTEN-398A蛋白在細(xì)胞核和質(zhì)膜穩(wěn)定定位(圖6A, B)。經(jīng)過(guò)IR處理后，PTEN-WT在質(zhì)膜上積累(圖6A, B)。相比之下，在這些條件下，沒(méi)有檢測(cè)到PTEN-398A蛋白的重新定位(圖6A, B)。B).我們通過(guò)細(xì)胞分離和膜相關(guān)PTEN的免疫印跡分析進(jìn)一步證實(shí)了這些結(jié)果(圖6C, D)。這些結(jié)果表明，ATM對(duì)PTEN的磷酸化導(dǎo)致PTEN在質(zhì)膜上重新分布，這與AKT通路激活減少有關(guān)