腫瘤抑制因子DRD2-乳腺癌治療靶點

 乳腺癌(BrCa)是世界范圍內(nèi)最常見的癌癥，診斷為IV期患者的5年相對生存率有所下降。晚期BrCa被認(rèn)為是不可治愈的，目前仍缺乏有效的治療策略。識別和表征新的腫瘤抑制基因?qū)τ诮⒂行У耐砥?/span>BrCa預(yù)后生物標(biāo)志物或治療靶點非常重要。2021年3月發(fā)表于Theranostics（IF=11.556）的文獻(xiàn)“Tumor suppressor DRD2 facilitates M1 macrophages and restricts NF-κB signaling to trigger pyroptosis in breast cancer”對此展開了研究。在本文中，在BrCa中，DRD2被發(fā)現(xiàn)由于啟動子甲基化而下調(diào)。DRD2的高表達(dá)與更長的生存時間正相關(guān)，尤其是在HER2陽性患者中。DRD2還能促進(jìn)BrCa細(xì)胞對紫杉醇的敏感性。DRD2異位表達(dá)顯著抑制BrCa腫瘤發(fā)生。在體內(nèi)和體外，DRD2也能誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和壞死。DRD2通過與β-arrestin2、DDX5和eEF1A2相互作用抑制NF-κB信號通路的激活。有趣的是，DRD2還調(diào)節(jié)微環(huán)境，促進(jìn)巨噬細(xì)胞M1極化，并觸發(fā)GSDME執(zhí)行的焦亡。

技術(shù)路線

結(jié)果
1）DRD2通過啟動子甲基化在轉(zhuǎn)錄上下調(diào)
    為了研究新的潛在TSGs，采用BrCa組織和正常組織進(jìn)行RNA-seq篩選。與正常乳腺組織相比，BrCa組織中DRD2 mRNA表達(dá)明顯下調(diào)(圖1A)。免疫組化染色發(fā)現(xiàn)，與BrCa組織相比，正常乳腺組織中DRD2蛋白水平也較高(圖1B)。同樣，基于TCGA，在BrCa中也觀察到DRD2 mRNA的下調(diào)，并且在BrCa中DRD2啟動子甲基化也更頻繁(圖1C)。根據(jù)Kmplot，DRD2的高表達(dá)促進(jìn)了BrCa患者的更長的生存期，這也在HER2陽性基因型患者中可見。但這一優(yōu)勢在Luminal A患者中未見(圖1D)。根據(jù)RT-PCR和MSP結(jié)果，幾乎所有的BrCa細(xì)胞系與永凍的正常乳腺細(xì)胞系相比，都可以看到DRD2 mRNA表達(dá)下調(diào)或缺失以及啟動子甲基化(圖1E)。因此，DRD2的高甲基化頻率可能有助于其下調(diào)BrCa。Aza藥物去甲基化恢復(fù)了兩種沉默的BrCa細(xì)胞系MDA-MB231和BT549中DRD2的表達(dá)(圖1F)。

2）在體內(nèi)和體外，DRD2的表達(dá)抑制BrCa細(xì)胞的腫瘤發(fā)生

構(gòu)建過表達(dá)DRD2的MDA-MB231和BT549細(xì)胞，通過RT-PCR (Figure 2A)和WB (Figure 2B)驗證。CCK8實驗證明，DRD2異位表達(dá)抑制腫瘤細(xì)胞生長(圖2C)。在單層集落形成實驗(圖2D)和軟瓊脂形成實驗(圖2E)中，DRD2也損害了存活能力。并進(jìn)行細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期分布分析。DRD2的表達(dá)顯著促進(jìn)了BrCa細(xì)胞凋亡(圖2F)，并阻斷了MDA-MB231和BT549在G2/M期的凋亡(圖2G)。此外，過表達(dá)DRD2促進(jìn)了BrCa細(xì)胞對PTX的敏感性(圖2H)。在傷口愈合實驗中，異位表達(dá)的DRD2比對照組表現(xiàn)出更少的閉合人工傷口的能力(圖2I)。與此相一致的是，DRD2的過表達(dá)顯著降低了BrCa的遷移和侵襲(圖2J)。在體內(nèi)進(jìn)一步測定了DRD2的抑瘤作用。皮下腫瘤模型顯示過表達(dá)DRD2模型的腫瘤體積和重量均減小(圖2K)。

3）DRD2重新編碼Mφ M1表型，下調(diào)IL-6和IL-10

據(jù)報道，DRD2可調(diào)節(jié)M1的極化。結(jié)果顯示，在DRD2表達(dá)水平較高的BrCa組織中，M1 Mφ的浸潤增加，M2 Mφ的浸潤減少(圖3A)。為進(jìn)一步研究DRD2對TAMs的調(diào)控作用，構(gòu)建了BrCa與Mφ共培養(yǎng)體系。當(dāng)Mφ與表達(dá)DRD2的BrCa細(xì)胞共培養(yǎng)時，qRT-PCR顯示M1表型標(biāo)記增加，M2 Mφ標(biāo)記下調(diào)(圖3B-C)。qRT-PCR也證實了載體轉(zhuǎn)染的BrCa細(xì)胞將Mφ調(diào)節(jié)為M2型(圖3C)[12]。WB結(jié)果顯示，表達(dá)DRD2的BrCa細(xì)胞上調(diào)M1標(biāo)記iNOS，下調(diào)M2標(biāo)記CD206(圖3D)。IF染色顯示，與表達(dá)DRD2的腫瘤細(xì)胞共培養(yǎng)后，Mφ表現(xiàn)為M1表型(圖3E)。上述結(jié)果表明，BrCa中的DRD2具有將Mφ重新編碼為M1表型的能力。

為了探索使Mφ向M1表型分化的關(guān)鍵調(diào)控因子，我們進(jìn)行了細(xì)胞因子陣列分析。結(jié)果表明，TNF-α和兩種誘導(dǎo)M1極化的經(jīng)典細(xì)胞因子IFN γ均未增加。而與Mφ共培養(yǎng)后，DRD2顯著下調(diào)IL-6和IL-10(圖3F)。分析熒光值，進(jìn)一步證實IL-6和IL-10下調(diào)(圖3F)。因此，DRD2可以將Mφ重新編碼為M1表型，并在crosstalk過程中顯著下調(diào)IL-6和IL-10。

4）DRD2重編程的Mφ誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的焦亡

如HE所示，來自小鼠模型的腫瘤承載DRD2顯示腫瘤細(xì)胞死亡增加(圖4A)。在免疫組化染色中，表達(dá)DRD2的4T1腫瘤樣本中pMLKL表達(dá)較高(圖4A)。根據(jù)TUNEL實驗，DRD2也促進(jìn)了體內(nèi)細(xì)胞凋亡(圖4B)。DRD2上調(diào)GSDME而不是GSDMD(圖4C)。在crosstalk過程中，Mφ進(jìn)一步促進(jìn)了DRD2轉(zhuǎn)染的BrCa細(xì)胞中GSDME的表達(dá)(圖4C)。在表達(dá)DRD2的BrCa細(xì)胞中，Mφ也能上調(diào)IL-1β(圖4C)。WB結(jié)果表明，DRD2誘導(dǎo)了MLKL的磷酸化，而在共培養(yǎng)過程中，MLKL被Mφ抑制(圖4D)。此外，DRD2表達(dá)激活了caspase-8，而激活被Mφ抑制(圖4D)。假設(shè)，DRD2可能在與Mφ crosstalk時誘發(fā)焦亡。BrCa細(xì)胞中與Mφ共培養(yǎng)時，NLRP3在表達(dá)DRD2的BrCa細(xì)胞中被觸發(fā)。激活的caspase-1蛋白水解也能誘導(dǎo)IL-1β和IL-18的成熟(圖4D)。在共培養(yǎng)過程中，Cleaved caspase-3表達(dá)上調(diào)(圖4D)。此外，在共培養(yǎng)過程中發(fā)現(xiàn)表達(dá)DRD2的BrCa細(xì)胞中，GSDME的N端發(fā)生了剪切(圖4D)。為了確定是否由M1 Mφ引起焦亡，我們使用了LPS誘導(dǎo)的M1 Mφ培養(yǎng)基，結(jié)果表明，在表達(dá)DRD2的BrCa細(xì)胞中，M1 Mφ僅觸發(fā)NLRP3組裝并剪切GSDME(圖4E)。以上結(jié)果提示， M1 Mφ以DRD2依賴的方式觸發(fā)BrCa細(xì)胞的焦亡。

5）DRD2通過阻斷TAK1的磷酸化來限制NF-κB信號的激活

NF-κB信號的激活對于觸發(fā)炎癥小體組裝和隨后的焦亡是必不可少的。IF染色顯示DRD2幾乎阻斷了p-p65的核易位(圖5A)，但這種抑制被Mφ所抵消(圖5B)。核和細(xì)胞質(zhì)提取物也顯示DRD2抑制了p-p65的核易位(圖5C)。如WB結(jié)果所示，在LPS刺激下，DRD2抑制IKKα/β、IκBα和p65的磷酸化(圖5D)。異位DRD2表達(dá)也顯著抑制了Mφ誘導(dǎo)的p65磷酸化和IKKα/β的上游激活(圖5E)。WB結(jié)果顯示DRD2下調(diào)NF-κB的下游靶點ICAM-1。然而，這種下調(diào)被Mφ所抵消(圖5E)。抑制IKKα/β磷酸化提示DRD2負(fù)向介導(dǎo)IKK復(fù)合物上游。TAK1在催化IKKα和IKKβ中起關(guān)鍵作用。TAK1的磷酸化被異位DRD2表達(dá)顯著抑制(圖5D-E)。因此，DRD2通過阻斷上游激酶TAK1來抑制NF-κB信號通路的激活。

作為一種典型的G蛋白偶聯(lián)受體， DRD2的內(nèi)化誘導(dǎo)其受體β-arrestin2在質(zhì)膜上的募集，并增加其與β-arrestin2的親和力。LPS和CM刺激了DRD2和β-arrestin2的蛋白-蛋白結(jié)合(圖5F-G)。同時，通過IF染色觀察到，經(jīng)過LPS處理后，DRD2似乎在細(xì)胞質(zhì)中與p-p65結(jié)合(圖5A)， Co-IP和IB進(jìn)一步證實了這種結(jié)合(圖5F)。據(jù)報道，β-arrestin2信號的激活會破壞星形膠質(zhì)細(xì)胞中TAK1-Tab1的結(jié)合，而這種結(jié)合對于TAK1的激活至關(guān)重要。本研究還證實，內(nèi)化的DRD2可以促進(jìn)TAB1與β-arrestin2的結(jié)合，削弱TAB1與TAK1的結(jié)合(圖5H)。綜上所述，DRD2激活的β-arrestin2通過競爭性地結(jié)合TAB1來拮抗TAK1的磷酸化。

6）DRD2通過下調(diào)DDX5和eEF1A2來抑制NF-κB通路的激活和腫瘤的發(fā)生

DRD2異位表達(dá)顯著抑制了p65和NF-κB靶基因IL-10的mRNA表達(dá)(圖6A)，表明在沒有配體激活的情況下，DRD2是NF-κB通路的負(fù)調(diào)控因子。除了結(jié)合激活β-arrestin2外，DRD2還可能通過其他方式抑制NF-κB信號通路。采用Co-IP法分離可能的結(jié)合蛋白，并采用質(zhì)譜法進(jìn)行蛋白鑒定。MDA-MB231和BT549細(xì)胞的所有結(jié)合蛋白中，DDX5、eEF1A2和ICAM-1均被異位表達(dá)的DRD2下調(diào)(圖6B-C)。根據(jù)以往的研究，DDX5和eEF1A2是幾種癌癥中的兩種致癌基因。WB也證實了DDX5和eEF1A2蛋白水平下調(diào)(圖6D)。在293T和MDA-MB231中，通過Co-IP和IB實驗證實了DRD2、DDX5和eEF1A2的結(jié)合(圖6E)，表明這三種蛋白形成了一個復(fù)合物。根據(jù)以往的研究，DDX5可以結(jié)合p50，并協(xié)助IκB釋放p50。本研究還揭示了293T和MDA-MB231中DDX5與p50的結(jié)合(圖6E)。此外，有報道稱DRD2可在神經(jīng)系統(tǒng)中與EGFR結(jié)合。在BrCa細(xì)胞中，293T和MDA-MB231中也證實了DRD2和EGFR的結(jié)合(圖6E)。DRD2的表達(dá)下調(diào)ERBB1 (EGFR)和ERBB2 (HER2)的表達(dá)(圖6F)。在異位表達(dá)DRD2的BrCa細(xì)胞中，DDX5可以促進(jìn)p-IκBα的磷酸化，增加磷酸化p65的蛋白水平(圖6G)。eEF1A2可直接顯著上調(diào)p-p65的表達(dá)，而不影響IKKα/β或IκBα，甚至在沒有LPS的情況下，eEF1A2可上調(diào)表達(dá)DRD2的MDA-MB231的p-p65蛋白水平(圖6G)。以上結(jié)果表明，DDX5和eEF1A2對NF-κB信號通路的促進(jìn)作用受DRD2異位表達(dá)的抑制。

結(jié)論：這項研究新發(fā)現(xiàn)了一種腫瘤抑制基因-DRD2，可以提高BrCa患者的生存率和PTX治療反應(yīng)。DRD2誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和壞死，并在Mφ向M1重編程過程中進(jìn)一步觸發(fā)焦亡。DRD2通過與β-arrestin2結(jié)合，下調(diào)DDX5和eEF1A2，從而限制NF-κB信號通路的激活。DRD2是一種潛在的預(yù)測預(yù)后的生物標(biāo)志物，并且DRD2是BrCa中一個很有前途的治療靶點。